05/10/01 21:36:50
経験的にいって、
スクリーニングは-trp-leuで１００万個コロニーが出る条件で、
-his-adeプレートにまいて、コロニーが１００個でる程度が一番よく
本当のポジティブが取れる。
それ以上だと、擬陽性ばかりで話にならなくて、
それ以下（１０個以下）だと、なにも無い。
上に書いたぐらいの頻度になるように調整するには、作ったベイトと
空のベイトを-hisのプレートにぬってみて、同じぐらい生えるのを基準にするとよい。
それと、一つの遺伝子しかやらないと、外れる率があるから、なんだかんだといって、
５つぐらいの遺伝子について、それぞれやったほうがいいよ。
ちなみに、上にかいたのはクロンテックの酵母とプラスミドとライブラリーの話です。
ライブラリーはだれかが、増やしたものは使わないほうがいい。
ライブラリーはクロンテックから買ったのをちゃんとプレートで増やしたものを使わないと
分野によっては何もとれない。（分野によっては取れるけどね）
633:名無しゲノムのクローンさん
05/10/02 22:15:39
>>630 プラスミド回収のために50mlで培養だって？せいぜい1.5mlでやってますけど。
手抜きのときにはコロニーを掻きとってグラスビーズで潰して回収することすらあるけど。
634:名無しゲノムのクローンさん
05/10/02 22:17:01
>>629 PCRで良さげなバンドが出たなら、そのPCR産物をdirect sequencingしたら？
635:名無しゲノムのクローンさん
05/10/02 22:19:35
あ、それから-Trp-Leu-Hisで振るのは選択が掛かったままだから、複数のprey
が入ってるときにpositiveなプラスミドのコピー数が上がって、そっちが
取れやすくなるというメリットもあるよ。
636:名無しゲノムのクローンさん
05/10/02 22:33:51
実験をうまくやるコツは、これで大丈夫だよっていうのをまったく
信用しないで、基本どおりまずやることだよ。
バカにだまされないでね。
まあ、こういうと、みんな、たいていへそを曲げるんだけどね。
637:名無しゲノムのクローンさん
05/10/02 22:59:45
さすがにプラスミド回収のために50ml培養とは、基本に忠実とは言わんがな。
638:名無しゲノムのクローンさん
05/10/03 10:24:30
>>632
まあ、本当のポジティブとは何かという問題があるがなｗ
639:名無しゲノムのクローンさん
05/10/03 11:28:19
>>637
５０ｍｌの培地を数百振ってプラスミド回収するのは
ただのヴァカだよね。
640:名無しゲノムのクローンさん
05/10/04 00:36:51
まあまあ、>>636もちょっと偉そうなことが言ってみただけなんですから、見逃してやりましょうよ。
641:名無しゲノムのクローンさん
05/10/04 00:48:54
まあ、いいけど。
で、とれてんのポジティブ？？
642:名無しゲノムのクローンさん
05/10/04 14:38:35
大腸菌のtwo-hybrid使ってる人います？
Bacteriomatchのなんですけど…
これから使おうかと思ってるんですが
経験者が周りにいなくて、良いのか悪いのかも分からなくて。
643:名無しゲノムのクローンさん
05/10/05 00:16:36
器具は揃ってるけど、一から試薬を揃えて始める場合、
どれくらいのコストかかる？
644:名無しゲノムのクローンさん
05/10/05 00:17:35
全部買うか近所に分けてもらえるかで全然違う。
645:名無しゲノムのクローンさん
05/10/05 10:53:09
>>642
何の役にもたたない
646:609
05/10/06 00:20:03
AH109をストックから起こし直して，baitの形質転換体作り直しますた。
いままで使ってた種菌より元気な気がするのは気のせい？
来週からスクリーニング再開です。
本当に使うか分からないけど，3ATの濃度もポジコンとネガコンで検定しておきます。
>>634
PCRかけ直してみましたが，低分子の非特異以外はバンド1本でした。
精製も兼ねて，バンド切り出してからシーケンスかけました。
明朝どう出てますやら。
647:名無しゲノムのクローンさん
05/10/07 09:21:36
>>609
シーケンスどうだった？
648:609
05/10/12 23:52:40
連休でひと休み。
>>647
今度はちゃんと読めますた。きれいでした。ほっ
数個読んだのですが，どれも全くのゴミというわけではなさそうでした。
PCR産物をインサートにしてクローニングと，大腸菌に導入と
ボス指令で平行してやります。
Competentも新しく作り直したので，これでダメならelectroporationです。
明日はbait入りAH109にライブラリー導入。Ade+たくさん出ますように。
649:名無しゲノムのクローンさん
05/10/13 00:05:48
あんまりたくさん出ても困るよね。
650:名無しゲノムのクローンさん
05/10/13 00:32:12
インサートの無いMCSが読めたのは何だったのだろうね？
651:609
05/10/13 23:38:20
YPD Plus Liquidがコンタミしてた‥‥ショック。
仕方ないので普通のYPDでtransformしました。
やっぱり効率かなり落ちるんでしょうか？
Yeastmakerキットごと買い直すとろくまんえんだしなぁ
652:名無しゲノムのクローンさん
05/10/14 08:13:19
YPD plusって何が入ってるんだろね？
653:609
05/10/17 00:30:45
結局，トランスフォーメーションは10^4台しか入らず。
何がいけないんだろう？
今週のチェック項目
・pGBT9コントロールでのAH109トランスフォーメーション効率
・（ないと思うけど）baitの毒性：空ベクターとの増殖の比較
・ライブラリーの量と質
どうせキャリアDNAもそのうち足りなくなるし，キットも新しいの買ってもらおう。
これでPEGも新しくなるし。
新しいの届いたら今度は速攻分注です。
そういえば，YPDにA入れてないけどこれも関係あるのか‥‥
Matingに切り替えも視野に入れてY187のbaitも作りますか。
654:名無しゲノムのクローンさん
05/10/17 01:57:54
AH109ならYPDにはAde入れないとダメ。テキメンに効率落ちるよ。
655:？？？
05/10/26 21:02:49
とってもバカな質問だけどプラスミドとベクターとホストの関係を教えて。。。
656:名無しゲノムのクローンさん
05/11/01 02:01:26
>>655
プラスミド 輪っか状のDNA
ベクター 運び屋 プラスミド状のベクターに目的の遺伝子などを導入する
ホスト 宿主 大腸菌など ホストにベクターを導入→ホストを増やす→ベクターも増える
657:mate
05/11/01 20:05:35
はじめまして。ClontechのMATCHMAKER3とPretransformed Libraryを用いてMatingによるY2Hを
行っています。User Manual通り操作していますが接合効率が非常に悪く原因が判りません。
次回、Bait酵母数を増やしてMatingする予定なのですがどこまで増やしてよいのでしょうか？
ご存知の方、お教えください。また、接合時の振とう速度が速すぎるとMatingに悪影響があると
Manualには書いていますが逆に遅すぎるのもよくないのでしょうか？現在、15rpmにて行っています。
658:名無しゲノムのクローンさん
05/11/01 22:16:10
matingはなかなかトリッキーだよ。上手くいくときはすんなり行くんだけどね。
気をつけることはgrowthが良い状態に保つことと、振とう速度が速すぎたり遅すぎたりしないこと。
growthがstationaryに入っちゃうと接合しなくなるからね。振とうは、パートナーが出会う機会を
十分保ちつつ、接合しかけの細胞を剥がさないように。底に沈まない程度なら十分だと思う。
659:名無しゲノムのクローンさん
05/11/02 00:49:11
>>657
まずはBaitをフリーズストックから起こしなおしてみましょう。
あと，培地も作り直す。これだけでも改善することはよくります。
振盪は，例えば自分は2Lフラスコに50mLを入れて，40rpmでまわしてます。
同じくClontechのキット使い
660:mate
05/11/02 09:57:38
ありがとうございます。40rpmでもう一度トライしてみます。
Bait酵母数は5×10^9個で行っているのですがもう少し増やしたほうが
接合効率はあがるのでしょうか？あと細かい質問ですがmatingの際、
私も2Lフラスコを使用しているのですが、往復振とうと旋回振とうで
接合効率が変化し得るのでしょうか？変化するとすればどちらの振とうが
より効率的かご教授ください。よろしくお願いします。
661:609
05/11/02 21:53:55
しばらくです。
トランスフォーメーションはまだ1.3×10^5cfu/ugpGBT9くらいしか効率上がらず，
ライブラリーも40万クローンどまり。
-Trp/-Leuプレートに蒔き忘れて効率チェックできなかったり
スクリーニングプレートに蒔いてる間にトランスフォーメーション液こぼしたり（泣）
いろいろあったけど，Ade+コロニー100個越えたのでここらでひと休み。
とにかくシーケンス読むことにしました。
あまり効率上がらないようならmatingでのスクリーニングも考えてましたが
こちらも簡単にはいかないようですね。
プラスミドのレスキューですが，
酵母から大腸菌にelectroporationで直接回収している方っていますか？
662:名無しゲノムのクローンさん
05/11/02 22:24:00
うちでは上手くいかなかった＞ 酵母から大腸菌にelectroporationで直接回収
グラスビーズで潰してsupをそのままtransformationする方法を、コロニー１個
からにスケールダウンしてやってます。８割これで取れるので、残り２割を液培
して取り直してます。
663:609
05/11/02 23:02:31
レス忘れますた。
>>652
specially to promote transformationて書いてあるけど実に謎です。
YPDでrecoverしたら効率やっぱりよくなかった。
一回，両方で振って比較してみようと思ってるんですが，ライブラリーのときは
効率下げたくないんで，陽性クローンの再確認のときにやってみようかな。
>>654
ありがとうございます。YPDにAde加えたら（そのせいだけかわからんけど）
1ケタ効率上がりました。AH109の増殖自体も速くなって，OD上がりすぎて一回実験ダメにしましたw
>>662
そうですか…実はいま大腸菌のトランスフォーメーションでトラブル発生して困ってます。
competentを作り直そうとして，ふと，どうせならelectrocompetentで作って
一発で回収できれば楽でいいかなぁと。
Clontechのマニュアルには効率>10^9が必要とありましたが，どれくらい出るcompetentでしたか？
664:659
05/11/03 14:15:37
>>660
baitの数はなんとなく足りてる気がします。
ところで，空ベクター入りAH109とbaitベクター入りAH109で
mating効率が変わったりとかはありますか？
（単独でのレポーター活性が無いかを調べるときに，
空ベクター入りY187とmatingとかさせていると思いますが）
そもそもそこでおかしかったら，bait依存的ってことになってしまいます。
振盪は，うちは基本的にすべて旋回でやってます。
理由は分かりませんが，先輩にそう教わったもので。
でも，効率はかなり変わるでしょうね。
665:mate
05/11/03 19:54:30
空ベクター入りAH109とbaitベクター入りAH109での比較は行ったことはありません。
ただ、キット付属のコントロール酵母（AH109[pGBKT7-53]とY187[pGADT7-T])で
試しにmatingを行ったのですが私のBait酵母を用いたときと同様、接合効率が非常に
悪かったため、手法に問題があるのではないかと考えています。プロトコール通り
行っているつもりなのですが・・・。ちなみに単独でのレポーター活性、毒性などは
特に問題なかったです。一度接合時の振とう速度を変えてやってみます。
ありがとうございました。また報告します。
666:609
05/11/15 22:58:51
規制中？
667:609
05/11/27 00:25:10
ひさです。今週ミーティングがあるので実験に追われてます。
酵母から大腸菌へプラスミドを直接入れるのは成功率低いので，
簡略化したプラスミドプレップの後エレクトロポレーションでレスキューしています。
いまのところ，1酵母クローンあたり大腸菌のクローンは1種類なので
ややこしいことにはならず助かっています。
しかし，1つ1つクローンをレスキューしてミニプレップ→インサートチェック→シーケンスって
予想以上に力仕事ですね。聞いてはいましたが。
うちの環境だと，マシーンでミニプレップしたサンプルはそのままだと汚くて読めないので
1回精製のステップを入れないといけないのでかなりめんどいです。
まあ，しばらくはあまり頭使わず手を動かすだけなのでがしがしやります。
668:名無しゲノムのクローンさん
05/11/27 01:14:50
>>667
直接酵母をコロニーPCRにかければいいじゃん。ダメだった？
669:609
05/11/28 00:44:53
>>668
コロニーPCRは一応動いてはいるので，産物をダイレクトシーケンスでも
配列決定だけならよかったんですけどね。
その後の再形質転換とか，さらにその先の実験に使うことを考えると大腸菌にとった方がいいかなと。
あと，PCRのダイレクトシーケンスは一度ゲルからバンドを切り出さないとうまく読めなかったので
その手間が‥‥と思ってました。しかし今やってることの方が大変かも（汗）
βアクチンとか大腸菌にとっても仕方ないですし。
670:名無しゲノムのクローンさん
05/11/28 09:29:54
全てをコロニーPCRでやれって言ってるんじゃなくって、いくつか大腸菌に回収したら
それと同じプラスミドはコロニーPCRで簡単にハネられるじゃん。で、新しいものだけ
大腸菌に回収する。
671:名無しゲノムのクローンさん
06/01/07 17:43:58
Matchmakerのシステム３を使っているんですけど、
X-alpha-galでコロニーの青さってどのくらい意味あるのですか？
あれで結合の強さなどがどれくらい言えるのでしょうか？
コントロール並みに青くならない奴はやっぱりハズレなんですか？
詳しい人教えてください。
672:名無しゲノムのクローンさん
06/01/07 21:45:23
baitもしくはpreyのタンパク質の発現が酵母にtoxicでないかぎり
（形質転換体の生育がベクターのそれに比べて遜色がないかぎり）、
結合の強さと青色の濃さは相関してるよ。
コントロールはバリバリのポジティブだから、そこまで青くないポジティブは良くある。
673:名無しゲノムのクローンさん
06/02/02 19:15:02
one hybridの話だけど、
通常、ターゲット配列をレポーターに入れて、
cDNAライブラリ+ADを発現させてスクリーニングするよね。
これ、逆とかできるのかな？
つまり、ランダムな配列をレポーターに入れて、
ある転写因子+ADをベイト？にしてスクリーニングとか。
674:名無しゲノムのクローンさん
06/02/05 05:53:14
>>673
CHIPアッセイじゃだめなの？
675:名無しゲノムのクローンさん
06/05/01 20:35:33
age
676:名無しゲノムのクローンさん
06/05/01 22:31:25
>>673 そうやってp53のtargetを取った（と称する）仕事がサンタのところから出てなかったっけ？
677:名無しゲノムのクローンさん
06/05/20 11:08:19
すいません、Clontechのpretransformed libraryを買ったのですが、
非常に高価なので増やしてから使いたいのですが、SD-Leu-液体培地で振って
ストックを作ればいいのでしょうか？ Libraryの栄養マーカーはLeuです。
ストックを作るとき、なにか接合効率を上げるために操作を加えるのでしょうか？
678:名無しゲノムのクローンさん
06/05/20 11:17:27
SD-Leuで増やせば良いと思うよ。
679:名無しゲノムのクローンさん
06/05/23 00:55:57
え、マジで増やして大丈夫なの？>>pretransformed
増やして液体窒素で凍らせればおｋ？
680:名無しゲノムのクローンさん
06/05/27 22:50:05
machmakerのlibraryリストからpretransformedのlibraryはなくなっているね。
やっぱり、看板通りうまくいかないのかなあ？
全部Xho I-(dT)15をプライマーにして作っているけど、これはサイズカットしないでそのまま
vectorに入れているのかなあ？たとえばbaitが2.5kbサイズのmRNAでN末のところに結合するとき、
こういうドメインは本当にライブラリーの中に入っているのかなあ？
681:名無しゲノムのクローンさん
06/05/27 23:08:54
>>679
増やすことについては、Ｙｅｓ
だけど、10倍程度の増幅に留めておくが吉（それで十分でしょ）
液体窒素で凍らせることについては、Ｎｏ
大腸菌（液体窒素）と培養細胞（ゆっくり凍結）の間のサイズの細胞なので、
ディープフリーザーにチューブごと収めるが吉
682:名無しゲノムのクローンさん
06/05/28 03:40:54
beta-gal assayでフィルターに移してから、発色させるのは手間がかかるんだけど
大腸菌のプレートのように予め、アガーに入れておいて発色させるやり方で問題ないのでしょうか？
683:名無しゲノムのクローンさん
06/05/28 10:54:28
問題ある
684:名無しゲノムのクローンさん
06/05/30 01:59:42
もれ、プレート作るときに,x-gal入れているけど問題なく発色するぞ
Clontechのmanualにもplateに入れるやり方を使っている。
685:名無しゲノムのクローンさん
06/05/30 08:58:57
問題ある。細胞質に発現したbeta-galは、そのままではX-galをかけても発色しない。
フィルターアッセイはフィルターの上で溶菌させてbeta-galが外に出るようにしてる。
プレートに入れて染まることもあるけど、それはbeta-galの発現が高いというより、
溶菌しやすいコロニーが染まってることが多い。
plateに入れるのはalpha-gal＞Clontechのmanual
686:684
06/05/30 11:05:15
>>685 plateに入れるのはalpha-gal＞Clontechのmanual
スマソ。alpha-galだったわ～
687:名無しゲノムのクローンさん
06/05/30 15:52:57
なんでalpha-galならOKなの？
688:名無しゲノムのクローンさん
06/05/30 15:59:30
分泌されるから。
hostによるけどね。
689:名無しゲノムのクローンさん
06/05/31 00:02:08
原理も分からんで実験してる奴って結構いるんだね。
690:名無しゲノムのクローンさん
06/05/31 11:09:11
>分泌されるから。
分泌じゃなくて、細胞壁を通過して細胞質に入っていくからじゃないの？
691:名無しゲノムのクローンさん
06/05/31 11:25:09
>>690
はあ．．．ここにも原理を知らない奴が一人。
692:名無しゲノムのクローンさん
06/05/31 11:26:55
baitのサイズに関して質問なのですが、全長が2.8kbもある奴なんですが、全長を
そのまま、vectorに入れてもいいのでしょうか？
それともいくつかに分割して1kbくらいのものをオーバーラップさせていくつか作った方が
いいのでしょうか？
693:名無しゲノムのクローンさん
06/06/01 03:42:40
age
694:名無しゲノムのクローンさん
06/06/01 03:44:47
>>692
実験の原理を少しは考えやがれ
695:名無しゲノムのクローンさん
06/06/01 04:14:53
>>692
既に結合すると報告されたドメインをbait側のベクターに入れてもサイズによってポジティブにでたり
でなかったりする場合はけっこうある。たとえば５００bpの結合領域が入った部位を
いれて発色しても、この部位が入った2.8kbのものを同じベクターに入れても発色しない
ということはよくある話。だからいくつかのものを分割してオーバーラップする形で
baitを作った方が一般的にはうまくいく。
694は単なる馬鹿だから無視しろＷ
696:名無しゲノムのクローンさん
06/06/01 08:35:25
>>691
原理なんて知らなくても良い遺伝子が取れれば勝ち
697:名無しゲノムのクローンさん
06/06/01 23:00:01
>>696
勝ち負けが好きならもっと向いてる分野があるよ。
698:名無しゲノムのクローンさん
06/06/08 04:42:28
Y190使うと、IL-培養で、p15x25枚にまいて軽く10^7は突破するんだけど。
AH109を使うと、その１０分の１も行かない。
株はクローンテックのキットについてきたものを使っています。
どうしてだろうか？形質転換効率がめっちゃ低い。
699:名無しゲノムのクローンさん
06/06/08 07:53:24
漏れもAH109にbaitをtransformして、それにライブラリーを入れているんだけど
効率がめちゃ悪い。
メイティングしないと駄目なのかな？
700:名無しゲノムのクローンさん
06/06/08 09:03:50
それ、何かがおかしいよ。AH109はむしろ形質転換効率が良いことで知られている。
ＹＰＤじゃなくってアデニンを加えたYPADで培養してる？ baitにtoxicityがあったりしない？
ところで、10^7って、library DNAどのくらい使って？ IL-培養って何？
701:名無しゲノムのクローンさん
06/06/08 09:45:06
>>700
すでにbaitが入っているので、 SD 1L培養で、library50-100ugを一回の形質転換で
使っている。この方法では、Y190では問題なく行っているし、baitも同じものを
使っているので毒性の問題ではない。
702:名無しゲノムのクローンさん
06/06/08 09:48:16
どのプロトコールに従ってるかわからないけど、
ＳＤで前培養→ＹＰＡＤで本培養（３～４時間）でぐっと効率上がるよ。
この間の２回程度の分裂でのプラスミドの脱落は無視できる程度。
703:名無しゲノムのクローンさん
06/06/08 10:07:48
PEG溶液を新しくすると、おどろくほど改善することがある
704:名無しゲノムのクローンさん
06/06/08 11:04:48
50%PEG溶液って毎回作ってリフレッシュした方がいいのでしょうか？
それとも２－３ヶ月は保存可能でしょうか？
705:名無しゲノムのクローンさん
06/06/08 23:59:32
濃度が問題だから、しっかり密栓してあれば１年でもＯＫ。
チューブの口にPEGが析出するなどして水蒸気の出入りがあるなら１週間でもダメ。
706:名無しゲノムのクローンさん
06/07/26 16:34:05
こんにちは。現在5回膜貫通蛋白質の細胞質ドメインをベイトにtwo-hybridでスクリーニングをしています。
ベイトは3AT50mMでやっとバックグラウンドがおさえられたのですが、
スクリーニングプレートSD-LWH,SD-LWHAには無数のコロニーが生えてきてしまいました。
一応その中から大きいコロニーを700個拾ってきてα－gal活性を見ると、700個全て陽性という結果になりました。
候補を絞るにはgrowthcheckをすると教わったのですが、あまりにも候補が多すぎてこのまま進むべきではないような気がしています。どなたかアドバイスをお願いします。
707:名無しゲノムのクローンさん
06/07/27 08:22:58
このまま進むべきでないって判断は、経験的に言って正解です。
スクリーニングの仕方を変えた方がいいです。一番いいのは、ベイトを断片化して、バックグラウンドを生じる領域を
除いたベイトを作成することです。
708:名無しゲノムのクローンさん
07/04/04 23:29:37
こんどはじめようと思っております。
宝買収以前からClontechキットを使っている方が多いようですが、
Invitrogenと比べてどうなんでしょうか？
ざっと検討した感じではこんな感じですが、
Invitrogen- ベクターが低コピーで抑えられる、レポーターが３種類
Clontech- 売っているライブラリーが多い。
の他に違いがあるでしょうか？
709:名無しゲノムのクローンさん
07/04/04 23:48:50
迷ってる暇にサッサとやるが吉。ともかく、バックグラウンドの生えない条件で
ポジティブが出るかどうかは、やり始めてから３週間で決着がつく。
それがホンモノかどうかは、もはや酵母の実験のレベルでは分からない。
どっちのtwo-hybridのシステムが良いかなんて、エサのタンパク質に拠るし、
やってみるまで分からない。ともかく、そこは迷うところじゃない。
Clontechだって今やレポーターは３種類あるから、そこもポイントじゃない。
710:名無しゲノムのクローンさん
07/05/23 23:01:57
相互作用がわかっている組み合わせでやってみて何も出てこない。
53とTの組み合わせでは出るのでシステム自体は働いている。
シーケンスはチェックしている。-Leu-Tryプレートには生えているので、
Transformationの問題ではないし産物に毒性があると言うわけではなさそう。
フォールディングが上手く行っていないか、核にに移行していないと
いうことでしょうか？
711:名無しゲノムのクローンさん
07/05/24 08:08:15
翻訳効率が悪い
分解されやすい
立体障害で結合しない
いずれかの因子が活性化されることが結合に必要
etc.
712:710
07/05/25 00:23:33
N末C末を削ったものでもやってみたけど駄目。
他の相互作用する遺伝子をスクリーニングしようと思ったのですが、
撤退ですかね。
原因を究明しても対処できそうにはないし。
713:名無しゲノムのクローンさん
07/05/25 01:22:50
スリーハイブリットってなんですか？
714:名無しゲノムのクローンさん
07/05/25 09:25:45
>>710
てか、ホントに結合すんの？
誰かの捏造データだったんじゃ？
715:名無しゲノムのクローンさん
07/06/08 02:30:13
M2Hで網羅的解析のできる方法ってあるの？調べた限りないんだが．
716:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 00:39:35
>>710
酵母のtwo-hybridはシステムが変わると結合したりしなかったりする
酵母研究者の間では結構有名なんだけど。まあ、知らない人はしらなかったりする。
ベクター変えたり酵母を変えたりしただけで結合が見えなかったりするものなんだよ
IPとかとは違うんです
717:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 00:41:42
あっ、ちなみにtwo-hybridはがたがた言わずにとりあえずやれって授業で教わったことあるよ
718:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 01:22:38
ま、IPも擬陽性バリバリだけどな。
719:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 16:36:46
結局結合タンパク取るには何がベストなんだ？
720:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 16:43:24
>>718
おれは１０年かけてどんなものでもIPできる境地に達した。
IPはおれにまかせろｗ
721:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 17:57:11
酵母2-hybridでベイトコンストラクトがちゃんと発現してるか確認しないで使うのは御法度
イムノブロットとかでベイトコンストラクトがちゃんと予想分子量にシグナルがあるかどうか
調べた方が良い。
722:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 19:08:51
そんなことは無い。
ウエスタンで検出できる量よりはるかに少ない発現量で十分。
723:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 19:44:41
おれはクロンテックのシステムでmyc（HA？）の抗体でベイトを検出
できたことがない
724:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 20:47:53
最初,2hybridのベイトこさえて5mM 3-ATで生えてこなかった。念のためWBやったら切断されてて
DNA結合ドメインとベイトが分離していた。
リンカーを詰めて再度、ベイトをこさえたらDNA結合ドメインとベイトの合計分子量にバッチしシグナルが出た。
だがしかし、80mM 3-ATでも生えてきたよ、、、、、orz
725:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 21:28:56
lysate調整の時に切れたんじゃないの？＞WBやったら切断されてて
726:710
07/06/12 01:08:57
>>716
ありがとうございます。
とりあえず、Y187はあるのでそれでやってみるかな。
ベクターを変えるというのはGAL4のシステムからLexAに変えるということでしょうか？
それともGAL4で別のにするのでも意味があるのでしょうか？
>>721
ベクター変えるぐらいしか思いつきませんが、発現していない場合、
どういう対処法があるのでしょうか？
727:名無しゲノムのクローンさん
07/06/12 19:28:41
stratageneのcytotrapはいかがでしょうか。
核内と核外で普通に考えたらまったく異なる結果がでるはずですが。
経験者意見をお願いします。
当方細胞骨格系の遺伝子のy2hを考えています。
結局キットはclontechがいいんですか？
728:名無しゲノムのクローンさん
07/06/12 21:52:26
迷うよりやった方が早い。
何度も言わせるな。
729:名無しゲノムのクローンさん
07/06/13 01:10:49
俺は727ではないが。
やった方が早いとは言うけど、キット何十万もするからなあ
俺はmatch makerでいろいろとってきた経験があるからあれだが、
改良されたmatch makerは核内移行シグナルがついてるから、
cytotrapと同じ効果が得られるんじゃね？
それとも細胞質と核内じゃ結合環境が違うということか？
730:名無しゲノムのクローンさん
07/06/13 09:36:55
この人はどうしてそんなことが言い切れるのだろうか？＞核内と核外で普通に考えたらまったく異なる結果がでるはずですが。
731:名無しゲノムのクローンさん
07/06/13 11:58:52
全くということはないだろw
結局ADとBDに核内移行シグナルが付加されてるから普段核内にない分子が核に
入ってきて結合する．
だからいままで核には存在しない因子も取れてきている．
ただ微妙な塩濃度等？が影響している場合は取れない．
732:名無しゲノムのクローンさん
07/06/13 12:09:10
おまえらウダウダ言ってる暇があったら、
実際の細胞にタグ付き発現させてマス解析しろよ。
733:名無しゲノムのクローンさん
07/06/13 12:50:30
お前計画をしっかり立ててから実験しろ．
無駄な実験で人生無駄にしたいんですか？
734:名無しゲノムのクローンさん
07/06/13 23:13:58
二つのキットを比べたやつなんているか？
あれ１キットだけで50万だろ．
735:名無しゲノムのクローンさん
07/06/14 13:26:22
マッチメーカーよいよ．
クローンテックはライブラリーの質がすばらしいのでは？
SMART方は本当にすごい
736:名無しゲノムのクローンさん
07/06/14 23:36:56
クロンテックのカスタマーサービスのひどさはガチ
737:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 02:00:55
今の時代
免疫沈降やってでてきたバンドを切り出して
あるいはまとめたままの状態で、
LC-MS/MSするのがベストじゃね？
two hybridのメリットって何よ？
738:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 02:09:43
やればやっただけ時間が経つからピペット土方の暇つぶしになるよ
739:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 02:20:43
極微量しか発現しない因子も取れてくる可能性があると思うがどうよ？
素人ちゃんなんで、
大きなことは言えないが。
740:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 12:21:26
３週間（実労５日）で候補が取れること。
741:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 14:00:28
LCMSやるのにどれくらい金かかると思ってるんだ？
一つ一つバンド切り出してたら結合タンパクが多い場合
大変じゃないか？
742:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 14:26:16
ハビチュエーション因子の研究で清水先輩がLC-MSで検出したABC輸送体断片はなんだったんですか？
743:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 15:34:15
バカだなぁ。
どうせTHでものが取れたら細胞で免沈とかやって確認するんだろ、
だったら最初から免沈してマスの方が早いじゃねーか。
それに今時THで新規遺伝子取れて相互作用ドメイン決めましたとか言っても、
JBCが関の山だろ。
744:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 15:42:37
マスで取ったって改めて免沈のデータは要求されるだろが。
てか、グズグズ言ってるより論文出せよ、な。
745:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 15:48:10
マスが行ってりゃIPでウェスタンのバンドが出ないなんてことは無いだろ、１週間で出来る。
でもTHからだと、IPの実験系から組まなきゃ行けないじゃん。
746:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 15:53:52
てか、グズグズ言ってるより論文出せよ、な。
747:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 16:03:47
IPってそんなに大変か？
748:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 16:11:30
サイトトラップはホストの株をちょっといじらないとバックが酷いらしいよ。
>>747
モノによるよ。シングルIPなんかはあんまり信用されない時代だけどな。
最近はTAPtagという便利なのがあるから酵母屋さんは楽になったね。
749:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 21:31:52
てか質量分析やるにしてもバンドがたくさんある場合はどうするのよ？
あれってまとめてMSできるんだっけ？
マスコットサーチじゃ限界あるだろ？
750:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 00:08:17
俺プロテオミクスはあまりしらんが，LCMSMSってLCで分画を取るからなん種類タンパク質が混合さろていようが一回で解析できるんじゃね？
751:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 13:32:36
いまの流行はMudPITでしょ？
752:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 13:34:07
どっちでもいいから、論文出せよ、な。
753:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 14:04:51
>>752
revise中です＞＜b
754:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 17:46:14
mudpitって受託やっているところあるか？
受託どころか、日本で持っている研究室ほとんどないだろ？
日本だと現実的じゃないよ。
755:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 17:59:14
>>754
日本の事情はよくしらんけど理研でやってる人は何人かいるはずだよ。
アメリカでは普通にやってるねぇ。別に珍しくもなんともないよ。先週も
サンプル作ってfacilityに持ってった。
756:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 18:16:21
費用はいくらくらい？
うちは金持ちラボだが、
5サンプル出したら300万は軽く超えるだろ。
なかなか手を出しずらいよ。
757:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 18:34:43
1サンプル350ドルだったと思う。
まぁ安くはないけどね。
758:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 18:44:53
そんな安くないだろ。
俺のいるところは、
一回最低数十万はするぞ。
一時間あたり1万みたいな。
759:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 18:49:26
>>758
さぁ、どうなんだろうね。学内利用者と学外利用者で全然値段が違うらしいし
正直適正価格がどの辺りなのか、門外漢だから知らないなぁ。
けどルーチンでやってるから1サンプル数十万円ってのは有り得ないと思うよ。
760:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 19:04:05
》758
学外と学内では二割くらいしか違わないが、
大学によって格差があるんだよ。
探せば758の言うようなところ何箇所かあるよ。
高いところは設備が最新なのかもしれんが。
761:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 19:21:30
免沈して取れてくるタンパク質の同定なんて、
mudpit使わなくても、
nano-LC-MS/MSで十分じゃね？
mudpitは数十以上ある場合に使えばいいんじゃん？
nano-～だと何種類までオッケーなんだろうか？
762:名無しゲノムのクローンさん
08/01/13 23:30:36
全種類
763:名無しゲノムのクローンさん
08/01/14 14:12:18
誰だよage嵐してるの。
764:名無しゲノムのクローンさん
08/08/20 22:49:39
良スレage
765:名無しゲノムのクローンさん
08/08/21 21:39:31
今追い込まれながらtwo-hybridしてる…
でない…
766:水銀党SS隊員
08/08/22 01:30:22
2ハブリッドは二ヶ所のラボでやった、どっちもジャンク遺伝子しか釣れなかった
失った時間＞PRICELESS
767:名無しゲノムのクローンさん
08/08/22 02:47:09
>>765
捏っちゃえよ