03/02/21 09:14
がんがれよ。ところで、こういう風にイーストでたくさん取れた場合、条件を厳しく
するというがそれはどの程度効果的なのだろう？ いくら条件を厳しくするといって
も、イーストの話だよね。その条件を厳しくすることで、真ん丸での陽性率って上が
るのだろうか？
473:名無しゲノムのクローンさん
03/02/21 22:35
>>472
弱い相互作用は偽という前提で厳しくするから金銀財宝を失うこともある。
474:名無しゲノムのクローンさん
03/02/21 23:09
だからこそおいしそうなクローンを「くっつける」わけですわ。
475:名無しゲノムのクローンさん
03/02/25 03:30
厨房とは相互作用できん！
476:名無しゲノムのクローンさん
03/02/26 15:16
イーストでの相互作用の強さとまん丸細胞での免疫沈降での相互作用の強さは比例
するの？ もし比例するならイーストで真っ青のクローンを取ると免珍が出来やす
いってことになると思うけど、でも折れはそうは思えないんだよね。もし経験者が
いたら教えてYo!
477:応援します
03/02/26 15:18
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478:名無しゲノムのクローンさん
03/02/27 00:26
>>476
する。
479:名無しゲノムのクローンさん
03/02/27 09:32
>>478
だったらあるベイトに対して論文で報告された免沈もできるクローンがあるとする。
それをコントロールにしてそれよりも青く染まってるクローンを拾えば、かなりの
確率で免珍まで出来るクローンが取れるということになるんですが・・・本当にそ
うでしょうか・・・それならみんなもっと成功してるはずなんですけど。するって
だけでなくて具体的に教えていただけると幸いです。
480:名無しゲノムのクローンさん
03/02/27 19:25
>476
しない。
481:名無しゲノムのクローンさん
03/02/27 22:01
プロテインキナーゼと基質の相互作用って
Two-hybridで検証できるもん？
K>M変異体とか結合するけどリン酸化しない
不活性型キナーゼにしないとだめ？
482:名無しゲノムのクローンさん
03/02/27 22:09
ユビキチンープロテアソーム系を使った新しいタイプの
Two-hybridシステムについて教えて下さい
483:名無しゲノムのクローンさん
03/02/28 05:06
＞４８２ おれもしりたい
484:名無しゲノムのクローンさん
03/03/05 07:36
オーソドックスのものと比べてどういう利点があるんでしょうか？
また、これからの新しい手法にはどういう利点が求められているんでしょうか？
485:山崎渉
03/03/13 13:42
（＾＾）
486:山崎渉
03/03/13 13:50
（＾＾）
487:名無しゲノムのクローンさん
03/04/05 22:38
新年度あげ
488:名無しゲノムのクローンさん
03/04/08 22:41
>>484
利点
膜タンパク質にも使える。
転写活性化能を持って古典的two-hybridが使えないbaitにも使える。
欠点
経験の蓄積が少なくどこまで汎用性があるか不明。
試料が広く出回っていない。
ご近所に相談できる人がいない。
489:山崎渉
03/04/17 09:05
（＾＾）
490:名無しゲノムのクローンさん
03/04/23 00:58
みんなもうやってないの？
491:名無しゲノムのクローンさん
03/04/23 22:11
やらされてまつ
492:名無しゲノムのクローンさん
03/05/06 06:26
まーツーハイはスクリーニングにはおすすめしないね、俺は。
493:名無しゲノムのクローンさん
03/05/06 23:13
スクリーニングに使わないで何に使うと？
494:名無しゲノムのクローンさん
03/05/07 09:49
結合部位の決定
495:名無しゲノムのクローンさん
03/05/08 02:51
そうだな。俺もこの方法でスクリーニングはやりたくない。
496:名無しゲノムのクローンさん
03/05/16 02:06
学部にはちょうどいいだろう。
497:名無しゲノムのクローンさん
03/05/16 09:46
でもさ、major impact journalにコンスタントに出ている某ラボの論文、読んで
みたらほとんどがtwo-hybridで取った新しい分子の解析だったよ。もちろん取っ
てからの仕事が凄いんだけど。結局、アメリカのビッググラボが予想もしてない
ような分子を取って、こっそりデータを積み重ねるってスタイルにしようと思っ
たら、two-hybird位しかないんじゃない？
498:sage
03/05/16 10:09
>497
そのラボはY2Hに関してのノウハウの蓄積があるからこそできると思われるが、、。私も>494に同意。
499:名無しゲノムのクローンさん
03/05/16 10:18
>497,498
日本にもそういうラボがあるが、Y2Hに関してのノウハウの蓄積という
か、その後のデータをでっちあげるノウハウの蓄積があるんだと思う。
中には変異体の表現型まで一致するきれいな論文もあるが、怪しい
論文が多い。多すぎる。
実際にY2Hのクローニング論文がノックアウトなどで否定されている
のを何度も見たことがある。
500:動画直リン
03/05/16 10:25
URLﾘﾝｸ(homepage.mac.com)
501:名無しゲノムのクローンさん
03/05/16 10:46
Y2Hはむやみとリボゾームタンパク質やHSPがひっかかってくるよな。
502:名無しゲノムのクローンさん
03/05/16 10:51
URLﾘﾝｸ(www.fccc.edu)
false positiveの簡単な一覧です。参考までに。
503:名無しゲノムのクローンさん
03/05/17 19:20
とゆーわけでﾂｰﾊｲはｶﾞﾁﾝｺ向きでｽｸﾘｰﾆﾝｸﾞ向きではないとゆーことでよろしいか？
504:名無しゲノムのクローンさん
03/05/23 00:57
漏れもそう思うから意義無しっす。
505:山崎渉
03/05/28 14:24
∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ ( ＾＾ ） ＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
＝〔~∪￣￣〕
＝ ◎―◎ 山崎渉
506:酵母初心者です
03/06/08 00:58
だれかいたら教えてください。
酵母でインサートチェックのコロニーPCRやってるんですけど
同じ一つのコロニーでも、インサートが確認できたり、できなかったりで
結果が安定しません。
滅菌水10ulにコロニーをPickして１００℃で１０分ボイルしてその上清1ulを
サンプルにして、20ulの系でPCRを行っています（酵素はKOD Dashです）。
サンプル調製やサイクルなどでコツなど知っていらっしゃる方がいたら是非
教えて下さい。よろしくお願いします。
507:名無しゲノムのクローンさん
03/06/08 13:13
懐かしいスレが上がってるな。それはともかく、酵母のコロニーPCRはなかなかtrickyで決定版がないように思うが、とりあえずこんなのはどうだ？
URLﾘﾝｸ(www.vbl.yamaguchi-u.ac.jp)
URLﾘﾝｸ(www.users.kudpc.kyoto-u.ac.jp)
URLﾘﾝｸ(food.food.kyoto-u.ac.jp)
508:名無しゲノムのクローンさん
03/06/08 14:07
>>506
そもそもインサートチェックってのはアタリが出れば良し、じゃないの？
KOD dashを使ってる時点でリッチラボとみた。
増幅の長さを短くしては？３００ｂｐぐらいとか。
509:酵母初心者です
03/06/08 22:02
>>507
早速レスありがとうございます。
やっぱりZymolyaseで処理するのが一番確実なのでしょうか？
NaOHを使う方法は知りませんでした、早速明日試してみます。
ありがとうございました。
>>508
>>増幅の長さを短くしては？
というのはどういうことでしょうか？
説明不足だったのかも知れませんが、上に書いた「結果が安定しない」というのは
青コロニーをPickしてレプリカプレートに移して、再度コロニーPCRかけると
最初Pickした時検出できたインサートが検出できなくなったりすることが結構ある
ので何かプロトコールにまずい点があるのかと思ったのですが・・。
プライマーはMCSの両端を挟むプライマーを使っています。
510:名無しゲノムのクローンさん
03/06/09 09:38
コロニーPCRの失敗は多くの場合、菌体の入れすぎが原因と思われ。楊枝も物によっては悪さをするので、チップを使うのが吉。
511:酵母初心者です
03/06/09 23:19
みなさんありがとうございました！！
NaOHでサンプル調製して、菌体の量少なくしたら、うまく行きました。
酵母が多すぎてもだめなんですね。素人なものでなるべく多いほうがいいのかと
思っていました。>>510さんありがとうございました。
もうスクリーニングの段階なので時すでに遅しなんですが、今後の参考のために
もう一つ・・・（ずうずうしくてすいません）。
Maitingさせた酵母をプレートにまく時、どのようにしてまくのがよいので
しょうか？？ というのは、生育してきた酵母がちゃんとコロニーに
ならず、一面に広がってしまったようなプレートがいくつかあって、部分的に
青いところはあってもどこまでが単一コロニーなのかわからないのでPickUP
できないものがありました。
播き方は大腸菌とほとんど同じで150ｍｍのプレートにX-Galを塗って１５分
くらい乾かして、そのあとコーンラージ棒で菌体を200ul塗り広げました。
乾かし方が甘かったのか・・、菌の量が多いのか・・、塗り方が下手なのか・・、
そういうプレートもたまにあるのか・・、知ってる方がいたら教えて下さい。
よろしくお願いします。
512:名無しゲノムのクローンさん
03/06/09 23:52
mating法はClontechのプロトコルだとどうしても菌体量が多くなりがちだ
よね。きれいに均一にまけてれば問題ないだろうけど。コツは十分プレー
トを乾かしておくことと（作ってから２日ほど室温に放置）、5mm径のグ
ラスビーズなどを使って均一にまくことかな。菌が厚くたまったあたりが
うっすら青いのは怪しいので無視。
513:酵母初心者です
03/06/10 00:34
グラスビーズって使ったことないんですけど、どうやって使うんでしょうか？？
あとプレートにはX-Galはあらかじめ混ぜておいたほうがいいってことでしょうか？
すいません、本当に初心者なもので。
514:名無しゲノムのクローンさん
03/06/10 08:46
platingしたい菌の懸濁液と、滅菌しておいたグラスビーズを15cm dishなら
10～20コくらいプレートに載せて（注ぎ？）、プレートを水平に縦縦横横とジャ
ラジャラ振ると均一に塗り広がる。グラスビーズは良く洗って再利用できるよ。
515:名無しゲノムのクローンさん
03/06/10 08:55
あ、X-α-Gal（だよね？）はあらかじめ混ぜておいた方が楽だけど、
platingの直前に塗り広げた場合よりは発色が薄くなると言われているけ
ど、強い相互作用を示すものなら気にしなくて良いんじゃないかな。Ade
Hisで選択をかけて生えてきたものが数百程度なら（パイロット実験を
やっておくっちゅうことね）、最初のスクリーニングのプレートにはX-α
-Galを入れないで、拾い直す次のプレートに多めに入れるという手も。
516:酵母初心者です
03/06/11 00:00
グラスビーズってそうやって使うんですね。
早速今日発注しておきました。
本当にご親切にありがとうございました。
517:名無しゲノムのクローンさん
03/06/11 00:59
も一つ言うと、150mmプレート使う意味ってあんまり無いんじゃない？直
径が150mm:90mmなら面積は25:9、高々2.5倍でしょ。あんな使いにくいプ
レート50枚まくより90mmのプレート150枚まく方が合理的だと思うけど。
やたら大きいプレートまいて仕事した気分になってる人、もう一度考え直
したら？
518:名無しゲノムのクローンさん
03/06/11 11:02
>517
そんなに使いにくいか？？？
519:名無しゲノムのクローンさん
03/06/12 01:32
酵母の相互作用系をやりたい初心者です、教えてください。
One-Hybridのライブラリー作成＆スクリリーニングキットって
使えますか？なんか出たばっかりなので手を出せずにいます。
ものはアラビです。よろしくおねがいします。
520:名無しゲノムのクローンさん
03/07/09 15:41
クロンテックはだめだね。Three-Hybrid Systemをやってみたけど、
お話にならない。BD, ADヒュージョンに加えて第３のタンパク
（アダプターみたいな感じのタンパク質）をMetプロモーターで誘導
発現させるんだけど、誘導のためにはメチオニンを抜いた培地に置換する。
ところがキットについてくる株(AH109, Y187)は調べたところ
メチオニンを抜いた培地では生育できなかった。
クロンテックに問い合わせたところ、理由は分からないがやはりこれらの株は
メチオニンを抜いた培地では生育しないらしい。
他の先生は苦労しながらも工夫して実験しているだとさ。
元の株が生育しない条件でどうやってスクリーニングしろっちゅうねん！
521:名無しゲノムのクローンさん
03/07/09 15:51
培地にちゃんと硫酸アンモニウムとか入れてる？
522:名無しゲノムのクローンさん
03/07/09 15:56
☆頑張ってまーす！！☆女の子が作ったサイトです☆
☆見て見て！！
URLﾘﾝｸ(yahooo.s2.x-beat.com)
523:名無しゲノムのクローンさん
03/07/10 11:26
age
524:名無しゲノムのクローンさん
03/07/10 21:17
>521
硫酸アンモニウムは終濃度がg/Lとなるように加えています。
クロンテックにMET関連の遺伝子に変異が入っているのか
聞いてみたのですが特にそのようなことはないということでした。
521さんはAH109株がメチオニンを抜いた培地で生育したのでしょうか？
だとしたらもう一度菌体を起こしなおして調べてみます。
525:名無しゲノムのクローンさん
03/07/10 21:24
>524
しかしＡＨ１０９のMetに変異が入ってるのは
うちのラボでは定説です。
いや、絶対入ってるって。
526:名無しゲノムのクローンさん
03/07/10 21:30
ＦＬＡＧとかＭｙｃとか複数のＴａｇ使ってＴＡＰしてとれたcomplexを元に、
Ｙ２Ｈ、ＩＰの実験を行いスクリーニングから取れたと言い張り、論文作成。
その後に、ＴＡＰで複合体をとった論文を作成。
この方法ならソコソココンスタントにＹ２Ｈの論文がかけるけどダメなの？
527:山崎 渉
03/07/12 12:15
__∧＿∧_
|（ ＾＾ ）| ＜寝るぽ（＾＾）
|＼⌒⌒⌒＼
＼ |⌒⌒⌒~| 山崎渉
~￣￣￣￣
528:山崎 渉
03/07/15 13:03
__∧＿∧_
|（ ＾＾ ）| ＜寝るぽ（＾＾）
|＼⌒⌒⌒＼
＼ |⌒⌒⌒~| 山崎渉
~￣￣￣￣
529:名無しゲノムのクローンさん
03/07/21 12:04
>>520
Y187がダメなのはClontechのカタログにもはっきりそう書いてある。
www.clontech.com/techinfo/vectors/ vectorsA-B/pdf/PT3212-5.pdf
だけど、AH109は大丈夫だって書いてあるし、pBridge+AH109でググッたら-MetでcultureしているＤ論もあったよ。
www.biosci.ohiou.edu/faculty/holzschu/liyun.thesis
530:なまえをいれてください
03/07/24 15:45
ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ？(俺を買え）」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。
531:名無しゲノムのクローンさん
03/08/02 02:33
本日のラボミーティングで、Two-hybrid系を立ち上げることになりました。
初心者で右も左もわからないので、入門用のプロトコール本や詳細の掲載されている
メーカーホームページなど紹介していただけると嬉しいです。
Yeastは扱ったことがないくらい初心者なのですが、現在どこのメーカーのシステム
が優れているのでしょうか？ 大腸菌でできるシステムがどこかからでていたような
気もするのですが、やっぱり真核細胞でやった方がよいのかな？？
（ウィルスのタンパクとアソシエートするマウスの感染細胞内タンパクを
cDNAライブラリーからスクリーニングしようと考えています）
よい情報を御存知の方、優しく指導してくださる先輩諸兄、基礎から叩き
込んでやろうという鬼教官の方々、よろしくです。
532:ぼるじょあ ◆yBEncckFOU
03/08/02 02:53
∧＿∧ ∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ （ ・３・） ( ＾＾ ） ＜これからも僕たちを応援して下さいね（＾＾）。
＝〔~∪￣￣￣∪￣￣〕
＝ ◎―――◎ 山崎渉&ぼるじょあ
533:名無しゲノムのクローンさん
03/08/04 23:52
>>531
ご近所に酵母やってる部屋があったら、そこの誰かに作法を教えてもらうのがなんつっても楽だよ。慣れればなんてことないんだけど、やってるヤツには当たり前すぎてプロトコルに書かれていないようなところに落とし穴があったりする。なんだったらうち来る？
534:名無しゲノムのクローンさん
03/08/06 16:56
今すぐ会いたいの。ひろみはあなたなしじゃもうだめみたい。。。。
私、ここにいるから・・・・・探しに来て、くれる？
７日間会費フリー、１０分間無料になってるの、だから来て♪
あなたに会えなくちゃ、寂しくて死んじゃいそうだから
待ってます。来てくださいね！
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535:名無しゲノムのクローンさん
03/08/06 22:35
ひろみって、ひょっとして広海？
536:名無しゲノムのクローンさん
03/08/06 22:45
広海＠遺○研
537:名無しゲノムのクローンさん
03/08/06 22:59
今すぐ会いたいの。ひろみはあなたなしじゃもうだめみたい。。。。
私、遺○研にいるから・・・・・ポスドクに来て、くれる？
７日間会費フリー、１０分間無料になってるの、だから来て♪
あなたに会えなくちゃ、寂しくて死んじゃいそうだから
待ってます。来てくださいね！
→ → → URLﾘﾝｸ(www.nig.ac.jp)
538:名無しゲノムのクローンさん
03/08/06 23:03
>>537
不覚にもワロタ
539:名無しゲノムのクローンさん
03/08/12 16:59
せっかくの夏休みなのにっ！アメリカはもう学校ないんだよっ！
むーっ。あたし、あなたに会いにいけないじゃなーいっ！
そーんなイライラ解消ってことで、なんと７日間１０分無料サービス中☆
URLﾘﾝｸ(www.gals-cafe.tv) ここでバイトしてるンだぁ♪
なつき、ずっとずっと待ってるからね！遊びに来てね！
え？・・・モチロン、遊びじゃなくてマジなのも大歓迎、だよ(*^.^*)
540:名無しゲノムのクローンさん
03/08/26 22:42
常陸の受託スクリーニング試した人いますか？
541:名無しゲノムのクローンさん
03/09/20 21:38
困った時のtwo-hybrid
542:名無しゲノムのクローンさん
03/10/13 11:16
オレはtwo-hybrid奴隷…
543:名無しゲノムのクローンさん
03/10/16 00:03
「イラストレイテッド」シリーズにtwo-hybridがついに出た！
544:名無しゲノムのクローンさん
03/10/18 07:34
>543
【どんなタンパク同士も】バイオ実験イラストレイテッド two-hybrid【くっつけてみせる !!】
みたいなキャッチコピーなんかな？
545:名無しゲノムのクローンさん
03/10/25 03:39
>>544
【ク○ンテックに】バイオ実験イラストレイテッド two-hybrid【騙されるな !!】
546:名無しゲノムのクローンさん
03/11/18 14:16
InvitrogenのProQuest Two-Hybrid System with Gateway Technologyを
使っているかた、いらっしゃいませんか？
スクリーニングした後、酵母からpreyプラスミドがうまくとれないんです。
547:名無しゲノムのクローンさん
03/11/18 18:25
>
>‥∞‥。☆゜‥∞‥゜★。‥∞‥。☆゜‥∞‥゜★。‥∞‥。☆゜
>
> ねえ、ちょっと・・・マジやばいんじゃない？ この動画！！
> ↓↓ ↓↓
> URLﾘﾝｸ(moro00.e-city.tv) URLﾘﾝｸ(moro00.e-city.tv)
>
> ハッキリ言って、丸見え！ 素人はお金のためなら何でもヤル。
> 撮られた時はこんなにバラ撒かれるとは思わなかったんだろね。
> けっこうカワイイ娘なのになぁ・・・ そのへん歩いてたりして！
>
>‥∞‥。☆゜‥∞‥゜★。‥∞‥。☆゜‥∞‥゜★。‥∞‥。☆゜
>
548:名無しゲノムのクローンさん
03/11/27 02:33
インビトロジェンのゲートウェイtwo-hybridはどうですか？
なんか簡単そうだけど。
549:名無しゲノムのクローンさん
03/11/30 16:09
>>546 酵母内でlow-copyのプラスミドなので回収でトラブルことがあります。どういう方法で回収していますか？
最悪の場合、prey specific primerでPCRして、Gatewayでsubcloningするという手もありますが。
550:名無しゲノムのクローンさん
03/12/01 20:09
プラスミド回収はいろいろ試しました。
kitのmanualに書いてある方法、ガラスビーズや酵素で
細胞壁を破壊する方法、またキアゲンのkitでも精製をやりました。
けど、どれもうまくいってません。
low-copyのプラスミドとはいえ、うまくいく人はちゃんと取れるのでしょうか？
また、このInvitrogen ProQuest Two-Hybrid Systemはプラスミドが
取りずらいだけで、あとは問題のないシステムなのでしょうか？
まわりにこのシステムを使っている人がいないのですごく不安です。
551:名無しゲノムのクローンさん
03/12/02 09:54
>>550 ProQuestはbackgroundも低いし形質転換の効率の良い宿主だし、良いシス
テムだと思うよ。それから、それだけいろいろ試してプラスミドが回収できない
のは、大腸菌のコンピテントセルの出来に問題があると思われ。Inoue法で丁寧
に作るか、electroporationにスイッチするかしたら？
552:名無しゲノムのクローンさん
03/12/02 10:15
酵母においてプラスミドが染色体に挿入されて、普通のプラスミドが落ちることはよくある。
ゲノムをとってPCRして終わり。
553:546
03/12/19 00:17
結局、形質転換はうまくいかなかったので、prey specific primerでinsertを
増やそうとしているのですが、ほとんど増えてきません。
よっぽどプラスミドが少ないのか、それともPCRを阻害する物質が入っているのか・・・
何か良い解決法はないでしょうか？
554:名無しゲノムのクローンさん
03/12/19 00:40
プレイベクターとベイトベクターが融合して巨大なプラスミドになって
回収されたことがある。
555:名無しゲノムのクローンさん
03/12/19 09:33
PCR前にDNAを精製する
556:名無しゲノムのクローンさん
03/12/19 12:52
サイトトラップ、どうよ？
557:名無しゲノムのクローンさん
03/12/19 23:48
>>556 reversionがチョト大杉。酵母に慣れた人に相談するがよろし。
558:名無しゲノムのクローンさん
03/12/21 00:25
>>551
へたったコンピだと入んないね
>>546
手を広げすぎて原因がつかみにくくなってると思われ
何かを改善しようと新しい方法に手を出すのことを悪いとは言わないが、
広げすぎても、結局何がなんだかわからない。
PCRテンプレはどの方法で取ったんだ？
もともと精製度が悪い条件でPCRすら伸びないものをコンピに入れても拒絶されるだろう
ローコピでもZymolase処理して、各ステップていねーに処理して、
10^7～10^8くらいのコンピにいれれば普通は入ると思われ
まさかローコピでないプラスミドでもザイモ処理法で取って入らないのなら手技に問題あろう
→ゴミがおおいこと原因と思われ
559:aa
04/05/01 17:54
保守、書き込み、あげ。
ぜんぜん書き込みがないね。
Two-Hybridって、もう流行が終わったの？
560:名無しゲノムのクローンさん
04/05/01 18:53
簡単すぎて論じることがあまりないの。
561:名無しゲノムのクローンさん
04/05/01 22:42
今や外注できるよね。日立のカスタムスクリーニングどう？
562:名無しゲノムのクローンさん
04/05/22 17:59
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564:名無しゲノムのクローンさん
04/05/26 22:02
mating法ばんじゃい！一発で10^7クローンをスクリーニングできた！
565:名無しゲノムのクローンさん
04/05/26 22:05
このスレもそろそろ3年か
566:名無しゲノムのクローンさん
04/05/31 20:21
低レベルな質問ですみません
培養細胞用のディッシュにyeast screening用の培地まいちゃったんですけど
大丈夫ですか？
寒天培地だけどポリエルリジンとかが悪さしたりとかしませんか？
作りなおしたほうがよいですか？
至急レスお願いします！
567:名無しゲノムのクローンさん
04/05/31 20:22
大丈夫だ。安心して実験しる。
568:名無しゲノムのクローンさん
04/05/31 23:36
コートされているシャーレだと高いだろ。ボスに見つからないよう注意せよ。
569:名無しゲノムのクローンさん
04/10/13 03:10:46
1はどうした
570:もぐ
04/12/27 16:25:12
初心者で２hyをやっていますが、どうもmating効率があがりません。
細胞数や培地や細胞状態、温度、プラスミドの変更、、、などあらゆるものをチェックしましたが原因不明です。なんかポイントがあるのでしょうか。教えてください。
こんなにコロニーが出てくれないと困ります。各酵母は元気なんです。
571:名無しゲノムのクローンさん
05/03/09 20:38:14
age
572:名無しゲノムのクローンさん
05/03/09 23:48:29
>>570
振り混ぜ過ぎ
573:名無しゲノムのクローンさん
05/03/10 00:29:56
>>570
PEGが古くなると、てきめんに酵母の形質転換効率が下がる。
リチウム溶液からPEGまで作り直すことを進める。
キャリアーDNA/RNAも1-5kbpぐらいの長めがいいらしい。
ハイブリダイゼーション用キャリアーDNAの数百bpは短すぎると聞いた。
574:名無しゲノムのクローンさん
05/03/10 00:33:29
DNA添加、PEG処理、DMSO添加、熱ショック、の後、軽く遠心してPEGを除き、YEB培地に
resuspendして2時間30度で振る、そのあと選択培地で３回洗って、選択培地アガーに
やさしく蒔く。
575:樽
05/03/10 01:19:27
ツーハイブリッドで泥沼にはまりかけてるので書き込みします。
酵母株はHF7cを用いてクロンテックのcDNAライブラリーを購入して
スクリーニングしています。
トラフォメ効率は高いのですが、3ATをプロトコル最高の15mMいれても
バックが高すぎて陽性コロニーがつつけない状態です。
ベイトは5つ作って自己活性化能が無いものを使っているのですが…
576:樽
05/03/10 01:23:52
実は以前も別のライブラリーを用いてスクリーニングしました。
トラフォメ効率が非常に低かったのですが、
コロニーの大小は差が見られたので大きめのコロニーをつついていました。
その後リトラでも陽性だったものをいくつかIP、pulldownして
みましたが、すべてネガでした。
ちなみにベイトはずっと同じものをSD(-Leu,-Trp,+His)に
継代したものを使っています
577:名無しゲノムのクローンさん
05/03/10 01:40:52
プレイのライブラリーをベイトを持つ酵母に導入するとバックが高くなる、、、
というのはベイトに繋いだ目的のタンパク質が、プレイのGAL4acid pachかVP16領域と相互作用してんではなかろうか？
ベイトコンストラクトが転写活性化能を持たなくても、空のプレイ
プラスミドを入れたら転写活性能が出るのでは？
以前のプレイライブラリーと今回ので、プレイプラスミドの転写活性化
領域に違いはあるのか？
ヲレは以前、培地に3-ATを50mMぐらい入れて気合いでポジティブなクローンを
とったことが有る。
578:名無しゲノムのクローンさん
05/03/10 09:27:13
>>573
matingの効率の話をしてるんであって、形質転換効率は関係ないよ。
579:名無しゲノムのクローンさん
05/03/10 09:34:11
>>575 いまいちよく分からないんだが、自己活性化能のないベイトを
選んだんだよな。それを選んだ時には15mM 3ATで生えなかったのか？
それなら継代中にベイトかホストに変異が入って生えるようになっち
ゃったってことじゃないの？一般論としてプラスミドを持った酵母は
プレートなどで継代し続けない方が良いよ。早い段階でグリセロール
ストックを作って、マメにそこから起こしなおすべき。
580:樽
05/03/10 12:10:44
>577
GAL4acid pachかVP16領域というのは知らなかったのですが、
プレイプラスミドの転写活性化領域は、同じベクターに
同じ制限酵素サイトで入っているので、同じだと思います。
空のプレイプラスミドを入れたら転写活性能が出るという可能性も
考えられますね。その場合、別のベイトを作り直すしか
ないのでしょうか？
>579
ベイトを選んだときの培地には3ATは入れておらず、3ATを
入れたのはライブラリーをトランスフォームした後の
選択培地のみです。ベイトのみで15m3ATで生えるかどうかは
今度調べてみたいと思います。
ベイトをずっと継代し続けたのは、教官にそれで問題ないと
言われたからなのですが、今度最後作り直してストックは
作ろうと思います。
581:名無しゲノムのクローンさん
05/03/10 12:15:41
なんも理解せずに手だけ動かしてるんだなw
Gal4やVP16でググレ
582:名無しゲノムのクローンさん
05/03/10 14:46:10
酵母2-hybridで接合するような実験ってあったか？
教えてくれ。
583:名無しゲノムのクローンさん
05/03/10 23:33:20
preyのlibraryをあらかじめ形質転換した酵母のlibraryがあるんよ。
これをbaitを持った酵母とmatingさせて、二倍体をscreeningする。
URLﾘﾝｸ(www.clontech.co.jp)
584:名無しゲノムのクローンさん
05/03/10 23:34:46
追加
genome wideの網羅的相互作用解析プロジェクトではこれを使っていることが多い。
585:名無しゲノムのクローンさん
05/03/10 23:44:26
thanx
586:Y2Hなななし
05/03/12 18:22:35
>>575
漏れは100mMの３AT入れてポジティブクローンが生えてきた・・・・数個だけど
しかもそこからprayプラスミド回収して塩基配列決定までしました・・・・
取りあえずボスはこの中のどれかが本命だと言ってます・・・・ほんまかいな・・・
587:名無しゲノムのクローンさん
05/03/12 22:46:39
配列決定する前にベイト、ネガコンと再形質転換して再現性と特異性を見とくべき。
特に思い込みの強いボスだと、面白そうな遺伝子の顔見ちゃってからじゃ再現性無いって言っても聞いてくれないなんてことにならないとも限らない。
588:名無しゲノムのクローンさん
05/04/14 00:10:10
これからtwo-hybridを立ち上げようと思っています。BD matchmakerの mammalian two hybrid assay kitを使ったことある方はいますか？mammalian cellの系は、酵母とくらべて効率はどうなんでしょうか？
589:名無しゲノムのクローンさん
05/04/14 00:15:15
懐かしの名スレが上がったな。
558日記つけてよ。
590:名無しゲノムのクローンさん
05/04/14 09:35:52
mammalianの系は特定の２つのタンパク質の相互作用の検定には使えても、新規相互作用分子のスクリーニングに使うのは難しかろう。
591:588
05/04/16 10:56:48
＞590
どうもありがとうございます。
特定の蛋白質間の検定に使おうと思ってます。
mammalの系は、matchmakerの他にTOPOなどでも出ているようですが、使ってみた方はいますか？
592:名無しゲノムのクローンさん
05/04/17 11:49:08
>>588 えーと、スクリーニングに使わないなら、何の効率について訊きたいの？
593:名無しゲノムのクローンさん
05/04/17 12:16:40
特定のタンパク質間の検定なら、酵母でツーハイ+哺乳類でtag付
のIPでいいんじゃないか？
594:名無し
05/04/17 18:24:18
基本的すぎる質問で申し訳ないのですが、誰か教えてください。
コロニーＰＣＲでは、コロニー、つまり大腸菌を系に加えて行いますよね？
そして、大腸菌内のプラスミドが増幅していきますけど、
このとき、この大腸菌の菌体、本体はどうなっているんですかね？
細胞壁が破れなくても、その中のプラスミドは増幅するんですか？
素人的には、増幅させたいプラスミドのみを系に加える、
というならば理解できるのですが、
プラスミドが大腸菌内にある状態で系に加えて、
細胞壁に囲まれた中にあるプラスミドが増幅するの？
という疑問があります。
誰か、教えてください。
595:名無しゲノムのクローンさん
05/04/17 18:33:02
大腸菌の脂質二重膜は９４度２分ぐらいの過熱処理でスカスカに壊れます。
外膜と細胞膜の間にあるペリプラズマ空間のペプチドグリカン細胞壁は
もとからスカスカですのでプラスミドぐらいの小さなDNAはくぐり抜けられます。
596:名無しゲノムのクローンさん
05/04/17 20:40:22
>>594 two-hybridと何の関係があるのか？
597:名無し
05/04/18 17:05:21
ごめんなさい。関係はありません。
スレでこんな事聞くのも申し訳ないと思いながらも、
気になって、書き込んでしまいました。
ありがとうございました。
598:588
05/04/19 11:46:05
レスありがとうございます。
＞593
すでにIPでは確認済みなんですが、mammalの細胞の中でも結合しているかどうかを確認したいんですよね。
酵母を使うことも考えたのですが、ラボではまったく酵母を扱っていないので、セットアップが面倒かな、と。mammalの細胞はルーチンで扱っているので、可能であればそちらでツーハイができれば、と思いました。
＞592
トランスフェクトの効率や、レポーターが非特異に発現しやすくないか、とかの情報があればうれしいです。「効率」というよりは、「使い勝手」と言った方がよいかもしれませんね。
何か情報をお持ちの方、教えていただければうれしいです。よろしくお願いします。
599:名無しゲノムのクローンさん
05/04/19 16:53:51
>>598
意味がよくわからないんだけど、哺乳類の細胞でIPしてついてるなら、
細胞の中で結合してるってことだろ？それでいいじゃん。
600:名無しゲノムのクローンさん
05/05/02 23:09:48
>>598
俺もわかんない。
mammalianでもtwo-hybridはいくつかの候補の中から
あくまでスクリーニングに使うものという認識だし。
俺があほなのかな？
どっちにしろそこまで分かっているけど、どうしてもやりたいというなら
酵母に戻る意味はないからmammalでやったほうが良いんじゃないでしょうか。
601:名無しゲノムのクローンさん
05/05/03 10:49:37
>>600
588さんがボスにいわれたことを理解できていないのか、そもそも
彼のボスがよくわかっていないのか、少し気になるな。
602:名無しゲノムのクローンさん
05/06/08 15:24:18
DUALSYSTEMSのDUAL membrane kit2ってどうなんでしょうか？
ご存知の方、使われてる方いましたら情報お願いします。
膜タンパクをベイトにスクリーニングやりたいなと考えています。
603:名無しゲノムのクローンさん
05/06/08 17:59:13
>>602
私も興味あるのですが、詳細を教えてもらえないでしょうか？
ググッても見つからなくて。
Cyto-trapとはどう違うのでしょうか？
604:602
05/06/09 15:01:52
>>603
レスが遅くなってすみません。
Cyto-trapはミリスチン化配列をつけてターゲットを膜に配置させますが、
膜タンパク質をベースとしたこのDUAL membraneでは膜タンパク質自身の持つ
配列（シグナル配列やミリスチン化配列など）で膜に移行するため
自然な形で相互作用が見れるのでは、と思っています。
Cyto-trapはあまり詳しくないので誤解しているかもしれませんが。
詳しくは以下のサイトをご参考にしてみてはいかがでしょうか
Dualsystems Biotech社
URLﾘﾝｸ(www.dsbiotech.ch)
日本代理店(?)コスモ・バイオ株式会社
URLﾘﾝｸ(www.cosmobio.co.jp)
URLﾘﾝｸ(www.cosmobio.co.jp)
「DUALmembrane kit 2」は販売終了していました･････
「DUALmembrane Starter Package」は８４万円かぁ（汗）
使われてる方いましたらぜひ情報お願いします。
605:603
05/06/09 22:12:31
>>602
ご丁寧にありがとうございます。
なるほど。
確かに興味深いですね。
Cyto-trapはいろいろ問題がこのスレでも言われてますものね。
私からもぜひ情報を頂きたいです。
けど、同じく84万円はうちの研究室では気楽に買えないです（涙）。
606:名無しゲノムのクローンさん
05/06/19 23:19:58
ageさせていただきます
607:ホスト
05/08/16 13:29:08
酵母のホスト細胞の選択なんですが、ラボに以下のストレインが
あるんですが、どれを選択するのかベストなんでしょうか？
Y190
CG1945
HF7C
SFY526
AH109
608:名無しゲノムのクローンさん
05/08/17 00:42:08
age
609:名無しゲノムのクローンさん
05/09/24 02:43:58
1から一気に読んだ。疲れた。
最近実験デビューしたばっかりの超初心者がボス指令で臨むtwo-hybrid。
日記には‥‥できるかなぁ（汗）
とりあえずX-α-Galも手元になく，スクリーニング開始後に3AT濃度検討とか
なんか早くも迷走中？
His+クローン星の数ほど生えるけどAde+どこにいるんでしょうか。とほほ。
610:名無しゲノムのクローンさん
05/09/24 06:21:03
>>609
一応、Wanker のところの Y2H データーベースとか、みといた方がいいと思うぞ。
出てたからやらないとか言うもんでは無いとは思うが。
URLﾘﾝｸ(141.80.164.19)
611:名無しゲノムのクローンさん
05/09/24 23:43:52
>>607
文句無しでAH109。形質転換効率も高いし、何よりHis+Adeの選択は強力だ。
612:名無しゲノムのクローンさん
05/09/26 23:26:01
X-β-Galはプレート上では感度が低いので勧めないと
ClontechのYPHには書いてるけど，やっぱりαじゃないとダメでしょうか。
プラスミドの回収は原始的にガラスビーズですが
Zymoprepの方がやっぱりいいのかなぁ。
細かく分からないことだらけ。
>>610
なんだかうまく見られないけどがんばってみます。
613:名無しゲノムのクローンさん
05/09/26 23:34:11
ＡＨ１０９はベータだとプレートは不可能だよ。
つーかアルファもだめだって。
ＨＩＳとＡＤＥだけで、スクリーニングはＯＫだよ。まじで。
あと、３ＡＴは必要ないよ。つーか３ＡＴをいれないとダメなときは
絶対何もとれない。そのときはベイトを断片化してから
スクリーニングをやり直すべし。
ベイトをつくったときに、からのプラスミドを入れたのと、ＨＩＳのプレートに
ぬって比べてみ。
からのプラスミドより元気に生えたらもう、擬陽性だらけになるからダメ。
そのときは、ベイトに入れるインサートを小さくするんだよ。
614:名無しゲノムのクローンさん
05/09/26 23:42:04
AH109でHis+Adeの選択をかければ、まともなbaitならpositiveはそんなに
出ないはず。X-α-galもX-β-galも普通必要ないよ。
プラスミド回収はガラスビーズで十分。これもスケールダウンして、大きめ
のコロニー一個をそのまま20μLのスケールで潰して、上清の５μLを大腸菌
のtransformationに使うだけで、コンピの出来が良ければ100以上のコロニー
が出る。baitごとの特殊事情もあるけど、まずはやってみないと分からない
ので、ガンガレ。
615:名無しゲノムのクローンさん
05/09/27 00:23:32
>>613,>>614
マジですか‥‥baitだけ入れたAH109，-Trp-Hisプレートでかなり元気に生えます。
空baitベクターとの比較はしてませんけど。
条件検討では3AT 2.5mMか5mMの低濃度でバックグラウンド抑制できそうなのでいけるかと思ってました。
Adeで選択かけるとスクリーニングプレートほとんど何も生えてこないんです。
まあcotransformationが効率悪くてまだ10^4オーダーしかクローン検定できてませんけど。
次からsequentialに切り替えてみる予定なんです。
大腸菌のトランスフォーメーションはやっぱりelectroporationですか？
616:名無しゲノムのクローンさん
05/09/27 01:08:50
ちなみになぜかAH109はーadeはダメ。
かならず、-his-adeのプレートでないとダメだよ。理由はしらん。
１００万個ころにーだして、１００個ぐらいポジだったらＯＫだけど、それ以上だったら
やめたほうがいい。
エレポはめんどくさいので、おれは普通にケミカルこんぴつかってたよ。
617:名無しゲノムのクローンさん
05/09/28 22:28:40
すいません。
Baitを３種類作って、一回のスクリーニングで全部混ぜて、ライブラリースクリーニング
したら、一個のホスト細胞に入るプラスミドは、一種類だけなの？
それとも複数個はいるものなのでしょうか？
baitは同じ遺伝子で、少しずつドメインを変えただけど、要は、この遺伝子
産物につく遺伝子を取りたいのですが・・・
618:名無しゲノムのクローンさん
05/09/28 22:43:18
プラスミドの濃度にもよるけど、ある程度の形質転換体数を稼ぎたければ
そこそこの高濃度でやるだろうから、複数のプラスミドが入ることは普通。
下手すると２、３割くらいまでそうなる。手抜きをしないで、それぞれの
Baitに対してスクリーニングしたら？そこまでは大した手間じゃないんだから。
619:名無しゲノムのクローンさん
05/09/28 23:52:08
.>>複数のプラスミドが入ることは普通。
つうことは、positiveで拾ってきてコロニーから回収したライブラリー
由来のプラスミドのなかにもネガティブの混ざりものが混入している
ってこと？
セカンドで行かなかったから捨ててしまったコロニーが山のようにあるんだけど？
620:名無しゲノムのクローンさん
05/09/28 23:57:15
あくまでプラスミドの濃度による。大腸菌に回収する前に試しにpreyプラスミド
のクローニングサイトを挟むprimerでPCRしてごらんよ。私の経験では、
10^9の細胞を使って3.6 mlのスケールで形質転換するときに、20 ugのprey
libraryを形質転換して、出てきたpositiveの５％程度が複数のprey plasmid
を含んでいたよ。
621:名無しゲノムのクローンさん
05/09/29 00:04:41
でも、それならば、一個のコロニーから回収したプラスミドはmultipleに
なるはずだけど、これまでシークエンスして、一つのコロニー由来で
いろいろなプラスミドが取れたという経験はないんだけどなあ。
たいてい１０個回収したら、３－４個がdeletionなどが起きている奴で
intactの奴は、全部同じ遺伝子というケースがほとんどだった。
622:名無しゲノムのクローンさん
05/09/29 00:07:52
インサートが違えば大腸菌のTF効率もコロニーサイズも違うからね。
しかも５％程度だっていうんだから。そもそもどれくらいのDNAで
TFしてどれくらいの形質転換効率なのよ。
623:名無しゲノムのクローンさん
05/09/29 03:23:09
>ちなみになぜかAH109はーadeはダメ。
かならず、-his-adeのプレートでないとダメだよ。理由はしらん。
、-his+adeのプレート??
624:609
05/09/30 01:37:44
とりあえずAH109をフリーズストックから起こし直して，
連続トランスフォーメーションでもう１回スクリーニングかけることにしました。
-His-Adeにありったけまいてみます。
>616
試しにヒートショックかけてみましたが，うちのcompetentでは
10ugぐらいDNAつっこんでも１個もコロニー出てくれませんでした‥‥
まさかゲノムに組み込まれてないよなぁ。泳動流してみます。
625:609
05/10/01 00:12:11
Ade+クローン2個シーケンスしてみたら，片方読めず
もう片方はプライマーに挟まれたMCSがきれいに読めた。
インサート何も入ってないってどういうこと？？ はまってるかも。
-Trp-Leuでもう１回振ってプラスミド取り直します。
よく考えたら，プラスミド取りにいくときってpreyだけ欲しいから
-Leuで振った方がいいんじゃないかな？
626:名無しゲノムのクローンさん
05/10/01 09:28:06
よく考えなくてもそうだと思うがｗ
627:名無しゲノムのクローンさん
05/10/01 09:30:08
>>609 baitのベクター何使ってる？
628:名無しゲノムのクローンさん
05/10/01 09:48:07
>>609 インサート無しのクローンって、再形質転換してもAde+だった？
上で議論のあったみたいに、一つの酵母に複数のpreyプラスミドが入ってたんじゃないの？
629:609
05/10/01 19:46:45
>>628
PCRでインサートチェックしたらバンドは1本だけ（MCSよりサイズ大）だったので大丈夫かと‥‥
本当は再転換で結合の確認もしたいし，E.coliに入れてからシーケンスも読みたいんですが，
事情があって，偽陽性でもいいからcandidate候補のリスト出さなきゃならんのです。
確かに空ベクターと両方入ってる可能性あると思います。
>>627
ClontechのキットなのでpGBKT7です。一応preyのベクターに特異的なプライマー使ったはずです。
>>626
実験動き出してるのに後からこういうことばっかり‥‥（汗）
最初は律儀に-Trp-Leu-Hisで振ってますた。
でも，選択培地だと増殖に時間かかるからYPDでいいって言われたんですよ。
さすがにそれはやめました‥‥
630:名無しゲノムのクローンさん
05/10/01 21:26:04
そうそう、酵母にプラスミド入れたままにしてると、すぐにプラスミドがおかしくなるよ。
スクリーニングでポジティブが取れたら、すぐに-trp-leuの液体培地５０ｍｌに
コロニーをありったけいれて、３０度で、一晩から二晩振ってすぐにプラスミドを回収しないとだめだよ。
それと、酵母からプラスミドを回収するときは、エレクトロポレーションが標準だよ。
もし、ケミカルでしたければ、酵母の細胞壁成分を除くような方法でプラスミドをとらないとだめだよ。
631:名無しゲノムのクローンさん
05/10/01 21:28:12
それと、回収するときは、普通４つぐらいの独立した大腸菌のクローンから
プラスミド回収しないと、中には変なのが混ざっていることはよくあるよ。
632:名無しゲノムのクローンさん
05/10/01 21:36:50
経験的にいって、
スクリーニングは-trp-leuで１００万個コロニーが出る条件で、
-his-adeプレートにまいて、コロニーが１００個でる程度が一番よく
本当のポジティブが取れる。
それ以上だと、擬陽性ばかりで話にならなくて、
それ以下（１０個以下）だと、なにも無い。
上に書いたぐらいの頻度になるように調整するには、作ったベイトと
空のベイトを-hisのプレートにぬってみて、同じぐらい生えるのを基準にするとよい。
それと、一つの遺伝子しかやらないと、外れる率があるから、なんだかんだといって、
５つぐらいの遺伝子について、それぞれやったほうがいいよ。
ちなみに、上にかいたのはクロンテックの酵母とプラスミドとライブラリーの話です。
ライブラリーはだれかが、増やしたものは使わないほうがいい。
ライブラリーはクロンテックから買ったのをちゃんとプレートで増やしたものを使わないと
分野によっては何もとれない。（分野によっては取れるけどね）
633:名無しゲノムのクローンさん
05/10/02 22:15:39
>>630 プラスミド回収のために50mlで培養だって？せいぜい1.5mlでやってますけど。
手抜きのときにはコロニーを掻きとってグラスビーズで潰して回収することすらあるけど。
634:名無しゲノムのクローンさん
05/10/02 22:17:01
>>629 PCRで良さげなバンドが出たなら、そのPCR産物をdirect sequencingしたら？
635:名無しゲノムのクローンさん
05/10/02 22:19:35
あ、それから-Trp-Leu-Hisで振るのは選択が掛かったままだから、複数のprey
が入ってるときにpositiveなプラスミドのコピー数が上がって、そっちが
取れやすくなるというメリットもあるよ。
636:名無しゲノムのクローンさん
05/10/02 22:33:51
実験をうまくやるコツは、これで大丈夫だよっていうのをまったく
信用しないで、基本どおりまずやることだよ。
バカにだまされないでね。
まあ、こういうと、みんな、たいていへそを曲げるんだけどね。
637:名無しゲノムのクローンさん
05/10/02 22:59:45
さすがにプラスミド回収のために50ml培養とは、基本に忠実とは言わんがな。
638:名無しゲノムのクローンさん
05/10/03 10:24:30
>>632
まあ、本当のポジティブとは何かという問題があるがなｗ
639:名無しゲノムのクローンさん
05/10/03 11:28:19
>>637
５０ｍｌの培地を数百振ってプラスミド回収するのは
ただのヴァカだよね。
640:名無しゲノムのクローンさん
05/10/04 00:36:51
まあまあ、>>636もちょっと偉そうなことが言ってみただけなんですから、見逃してやりましょうよ。
641:名無しゲノムのクローンさん
05/10/04 00:48:54
まあ、いいけど。
で、とれてんのポジティブ？？
642:名無しゲノムのクローンさん
05/10/04 14:38:35
大腸菌のtwo-hybrid使ってる人います？
Bacteriomatchのなんですけど…
これから使おうかと思ってるんですが
経験者が周りにいなくて、良いのか悪いのかも分からなくて。
643:名無しゲノムのクローンさん
05/10/05 00:16:36
器具は揃ってるけど、一から試薬を揃えて始める場合、
どれくらいのコストかかる？
644:名無しゲノムのクローンさん
05/10/05 00:17:35
全部買うか近所に分けてもらえるかで全然違う。
645:名無しゲノムのクローンさん
05/10/05 10:53:09
>>642
何の役にもたたない
646:609
05/10/06 00:20:03
AH109をストックから起こし直して，baitの形質転換体作り直しますた。
いままで使ってた種菌より元気な気がするのは気のせい？
来週からスクリーニング再開です。
本当に使うか分からないけど，3ATの濃度もポジコンとネガコンで検定しておきます。
>>634
PCRかけ直してみましたが，低分子の非特異以外はバンド1本でした。
精製も兼ねて，バンド切り出してからシーケンスかけました。
明朝どう出てますやら。
647:名無しゲノムのクローンさん
05/10/07 09:21:36
>>609
シーケンスどうだった？
648:609
05/10/12 23:52:40
連休でひと休み。
>>647
今度はちゃんと読めますた。きれいでした。ほっ
数個読んだのですが，どれも全くのゴミというわけではなさそうでした。
PCR産物をインサートにしてクローニングと，大腸菌に導入と
ボス指令で平行してやります。
Competentも新しく作り直したので，これでダメならelectroporationです。
明日はbait入りAH109にライブラリー導入。Ade+たくさん出ますように。
649:名無しゲノムのクローンさん
05/10/13 00:05:48
あんまりたくさん出ても困るよね。
650:名無しゲノムのクローンさん
05/10/13 00:32:12
インサートの無いMCSが読めたのは何だったのだろうね？
651:609
05/10/13 23:38:20
YPD Plus Liquidがコンタミしてた‥‥ショック。
仕方ないので普通のYPDでtransformしました。
やっぱり効率かなり落ちるんでしょうか？
Yeastmakerキットごと買い直すとろくまんえんだしなぁ
652:名無しゲノムのクローンさん
05/10/14 08:13:19
YPD plusって何が入ってるんだろね？
653:609
05/10/17 00:30:45
結局，トランスフォーメーションは10^4台しか入らず。
何がいけないんだろう？
今週のチェック項目
・pGBT9コントロールでのAH109トランスフォーメーション効率
・（ないと思うけど）baitの毒性：空ベクターとの増殖の比較
・ライブラリーの量と質
どうせキャリアDNAもそのうち足りなくなるし，キットも新しいの買ってもらおう。
これでPEGも新しくなるし。
新しいの届いたら今度は速攻分注です。
そういえば，YPDにA入れてないけどこれも関係あるのか‥‥
Matingに切り替えも視野に入れてY187のbaitも作りますか。
654:名無しゲノムのクローンさん
05/10/17 01:57:54
AH109ならYPDにはAde入れないとダメ。テキメンに効率落ちるよ。
655:？？？
05/10/26 21:02:49
とってもバカな質問だけどプラスミドとベクターとホストの関係を教えて。。。
656:名無しゲノムのクローンさん
05/11/01 02:01:26
>>655
プラスミド 輪っか状のDNA
ベクター 運び屋 プラスミド状のベクターに目的の遺伝子などを導入する
ホスト 宿主 大腸菌など ホストにベクターを導入→ホストを増やす→ベクターも増える
657:mate
05/11/01 20:05:35
はじめまして。ClontechのMATCHMAKER3とPretransformed Libraryを用いてMatingによるY2Hを
行っています。User Manual通り操作していますが接合効率が非常に悪く原因が判りません。
次回、Bait酵母数を増やしてMatingする予定なのですがどこまで増やしてよいのでしょうか？
ご存知の方、お教えください。また、接合時の振とう速度が速すぎるとMatingに悪影響があると
Manualには書いていますが逆に遅すぎるのもよくないのでしょうか？現在、15rpmにて行っています。
658:名無しゲノムのクローンさん
05/11/01 22:16:10
matingはなかなかトリッキーだよ。上手くいくときはすんなり行くんだけどね。
気をつけることはgrowthが良い状態に保つことと、振とう速度が速すぎたり遅すぎたりしないこと。
growthがstationaryに入っちゃうと接合しなくなるからね。振とうは、パートナーが出会う機会を
十分保ちつつ、接合しかけの細胞を剥がさないように。底に沈まない程度なら十分だと思う。
659:名無しゲノムのクローンさん
05/11/02 00:49:11
>>657
まずはBaitをフリーズストックから起こしなおしてみましょう。
あと，培地も作り直す。これだけでも改善することはよくります。
振盪は，例えば自分は2Lフラスコに50mLを入れて，40rpmでまわしてます。
同じくClontechのキット使い
660:mate
05/11/02 09:57:38
ありがとうございます。40rpmでもう一度トライしてみます。
Bait酵母数は5×10^9個で行っているのですがもう少し増やしたほうが
接合効率はあがるのでしょうか？あと細かい質問ですがmatingの際、
私も2Lフラスコを使用しているのですが、往復振とうと旋回振とうで
接合効率が変化し得るのでしょうか？変化するとすればどちらの振とうが
より効率的かご教授ください。よろしくお願いします。
661:609
05/11/02 21:53:55
しばらくです。
トランスフォーメーションはまだ1.3×10^5cfu/ugpGBT9くらいしか効率上がらず，
ライブラリーも40万クローンどまり。
-Trp/-Leuプレートに蒔き忘れて効率チェックできなかったり
スクリーニングプレートに蒔いてる間にトランスフォーメーション液こぼしたり（泣）
いろいろあったけど，Ade+コロニー100個越えたのでここらでひと休み。
とにかくシーケンス読むことにしました。
あまり効率上がらないようならmatingでのスクリーニングも考えてましたが
こちらも簡単にはいかないようですね。
プラスミドのレスキューですが，
酵母から大腸菌にelectroporationで直接回収している方っていますか？
662:名無しゲノムのクローンさん
05/11/02 22:24:00
うちでは上手くいかなかった＞ 酵母から大腸菌にelectroporationで直接回収
グラスビーズで潰してsupをそのままtransformationする方法を、コロニー１個
からにスケールダウンしてやってます。８割これで取れるので、残り２割を液培
して取り直してます。
663:609
05/11/02 23:02:31
レス忘れますた。
>>652
specially to promote transformationて書いてあるけど実に謎です。
YPDでrecoverしたら効率やっぱりよくなかった。
一回，両方で振って比較してみようと思ってるんですが，ライブラリーのときは
効率下げたくないんで，陽性クローンの再確認のときにやってみようかな。
>>654
ありがとうございます。YPDにAde加えたら（そのせいだけかわからんけど）
1ケタ効率上がりました。AH109の増殖自体も速くなって，OD上がりすぎて一回実験ダメにしましたw
>>662
そうですか…実はいま大腸菌のトランスフォーメーションでトラブル発生して困ってます。
competentを作り直そうとして，ふと，どうせならelectrocompetentで作って
一発で回収できれば楽でいいかなぁと。
Clontechのマニュアルには効率>10^9が必要とありましたが，どれくらい出るcompetentでしたか？
664:659
05/11/03 14:15:37
>>660
baitの数はなんとなく足りてる気がします。
ところで，空ベクター入りAH109とbaitベクター入りAH109で
mating効率が変わったりとかはありますか？
（単独でのレポーター活性が無いかを調べるときに，
空ベクター入りY187とmatingとかさせていると思いますが）
そもそもそこでおかしかったら，bait依存的ってことになってしまいます。
振盪は，うちは基本的にすべて旋回でやってます。
理由は分かりませんが，先輩にそう教わったもので。
でも，効率はかなり変わるでしょうね。
665:mate
05/11/03 19:54:30
空ベクター入りAH109とbaitベクター入りAH109での比較は行ったことはありません。
ただ、キット付属のコントロール酵母（AH109[pGBKT7-53]とY187[pGADT7-T])で
試しにmatingを行ったのですが私のBait酵母を用いたときと同様、接合効率が非常に
悪かったため、手法に問題があるのではないかと考えています。プロトコール通り
行っているつもりなのですが・・・。ちなみに単独でのレポーター活性、毒性などは
特に問題なかったです。一度接合時の振とう速度を変えてやってみます。
ありがとうございました。また報告します。
666:609
05/11/15 22:58:51
規制中？
667:609
05/11/27 00:25:10
ひさです。今週ミーティングがあるので実験に追われてます。
酵母から大腸菌へプラスミドを直接入れるのは成功率低いので，
簡略化したプラスミドプレップの後エレクトロポレーションでレスキューしています。
いまのところ，1酵母クローンあたり大腸菌のクローンは1種類なので
ややこしいことにはならず助かっています。
しかし，1つ1つクローンをレスキューしてミニプレップ→インサートチェック→シーケンスって
予想以上に力仕事ですね。聞いてはいましたが。
うちの環境だと，マシーンでミニプレップしたサンプルはそのままだと汚くて読めないので
1回精製のステップを入れないといけないのでかなりめんどいです。
まあ，しばらくはあまり頭使わず手を動かすだけなのでがしがしやります。
668:名無しゲノムのクローンさん
05/11/27 01:14:50
>>667
直接酵母をコロニーPCRにかければいいじゃん。ダメだった？
669:609
05/11/28 00:44:53
>>668
コロニーPCRは一応動いてはいるので，産物をダイレクトシーケンスでも
配列決定だけならよかったんですけどね。
その後の再形質転換とか，さらにその先の実験に使うことを考えると大腸菌にとった方がいいかなと。
あと，PCRのダイレクトシーケンスは一度ゲルからバンドを切り出さないとうまく読めなかったので
その手間が‥‥と思ってました。しかし今やってることの方が大変かも（汗）
βアクチンとか大腸菌にとっても仕方ないですし。
670:名無しゲノムのクローンさん
05/11/28 09:29:54
全てをコロニーPCRでやれって言ってるんじゃなくって、いくつか大腸菌に回収したら
それと同じプラスミドはコロニーPCRで簡単にハネられるじゃん。で、新しいものだけ
大腸菌に回収する。
671:名無しゲノムのクローンさん
06/01/07 17:43:58
Matchmakerのシステム３を使っているんですけど、
X-alpha-galでコロニーの青さってどのくらい意味あるのですか？
あれで結合の強さなどがどれくらい言えるのでしょうか？
コントロール並みに青くならない奴はやっぱりハズレなんですか？
詳しい人教えてください。
672:名無しゲノムのクローンさん
06/01/07 21:45:23
baitもしくはpreyのタンパク質の発現が酵母にtoxicでないかぎり
（形質転換体の生育がベクターのそれに比べて遜色がないかぎり）、
結合の強さと青色の濃さは相関してるよ。
コントロールはバリバリのポジティブだから、そこまで青くないポジティブは良くある。
673:名無しゲノムのクローンさん
06/02/02 19:15:02
one hybridの話だけど、
通常、ターゲット配列をレポーターに入れて、
cDNAライブラリ+ADを発現させてスクリーニングするよね。
これ、逆とかできるのかな？
つまり、ランダムな配列をレポーターに入れて、
ある転写因子+ADをベイト？にしてスクリーニングとか。
674:名無しゲノムのクローンさん
06/02/05 05:53:14
>>673
CHIPアッセイじゃだめなの？
675:名無しゲノムのクローンさん
06/05/01 20:35:33
age
676:名無しゲノムのクローンさん
06/05/01 22:31:25
>>673 そうやってp53のtargetを取った（と称する）仕事がサンタのところから出てなかったっけ？
677:名無しゲノムのクローンさん
06/05/20 11:08:19
すいません、Clontechのpretransformed libraryを買ったのですが、
非常に高価なので増やしてから使いたいのですが、SD-Leu-液体培地で振って
ストックを作ればいいのでしょうか？ Libraryの栄養マーカーはLeuです。
ストックを作るとき、なにか接合効率を上げるために操作を加えるのでしょうか？
678:名無しゲノムのクローンさん
06/05/20 11:17:27
SD-Leuで増やせば良いと思うよ。
679:名無しゲノムのクローンさん
06/05/23 00:55:57
え、マジで増やして大丈夫なの？>>pretransformed
増やして液体窒素で凍らせればおｋ？
680:名無しゲノムのクローンさん
06/05/27 22:50:05
machmakerのlibraryリストからpretransformedのlibraryはなくなっているね。
やっぱり、看板通りうまくいかないのかなあ？
全部Xho I-(dT)15をプライマーにして作っているけど、これはサイズカットしないでそのまま
vectorに入れているのかなあ？たとえばbaitが2.5kbサイズのmRNAでN末のところに結合するとき、
こういうドメインは本当にライブラリーの中に入っているのかなあ？
681:名無しゲノムのクローンさん
06/05/27 23:08:54
>>679
増やすことについては、Ｙｅｓ
だけど、10倍程度の増幅に留めておくが吉（それで十分でしょ）
液体窒素で凍らせることについては、Ｎｏ
大腸菌（液体窒素）と培養細胞（ゆっくり凍結）の間のサイズの細胞なので、
ディープフリーザーにチューブごと収めるが吉
682:名無しゲノムのクローンさん
06/05/28 03:40:54
beta-gal assayでフィルターに移してから、発色させるのは手間がかかるんだけど
大腸菌のプレートのように予め、アガーに入れておいて発色させるやり方で問題ないのでしょうか？
683:名無しゲノムのクローンさん
06/05/28 10:54:28
問題ある
684:名無しゲノムのクローンさん
06/05/30 01:59:42
もれ、プレート作るときに,x-gal入れているけど問題なく発色するぞ
Clontechのmanualにもplateに入れるやり方を使っている。
685:名無しゲノムのクローンさん
06/05/30 08:58:57
問題ある。細胞質に発現したbeta-galは、そのままではX-galをかけても発色しない。
フィルターアッセイはフィルターの上で溶菌させてbeta-galが外に出るようにしてる。
プレートに入れて染まることもあるけど、それはbeta-galの発現が高いというより、
溶菌しやすいコロニーが染まってることが多い。
plateに入れるのはalpha-gal＞Clontechのmanual
686:684
06/05/30 11:05:15
>>685 plateに入れるのはalpha-gal＞Clontechのmanual
スマソ。alpha-galだったわ～
687:名無しゲノムのクローンさん
06/05/30 15:52:57
なんでalpha-galならOKなの？
688:名無しゲノムのクローンさん
06/05/30 15:59:30
分泌されるから。
hostによるけどね。
689:名無しゲノムのクローンさん
06/05/31 00:02:08
原理も分からんで実験してる奴って結構いるんだね。
690:名無しゲノムのクローンさん
06/05/31 11:09:11
>分泌されるから。
分泌じゃなくて、細胞壁を通過して細胞質に入っていくからじゃないの？
691:名無しゲノムのクローンさん
06/05/31 11:25:09
>>690
はあ．．．ここにも原理を知らない奴が一人。
692:名無しゲノムのクローンさん
06/05/31 11:26:55
baitのサイズに関して質問なのですが、全長が2.8kbもある奴なんですが、全長を
そのまま、vectorに入れてもいいのでしょうか？
それともいくつかに分割して1kbくらいのものをオーバーラップさせていくつか作った方が
いいのでしょうか？
693:名無しゲノムのクローンさん
06/06/01 03:42:40
age
694:名無しゲノムのクローンさん
06/06/01 03:44:47
>>692
実験の原理を少しは考えやがれ
695:名無しゲノムのクローンさん
06/06/01 04:14:53
>>692
既に結合すると報告されたドメインをbait側のベクターに入れてもサイズによってポジティブにでたり
でなかったりする場合はけっこうある。たとえば５００bpの結合領域が入った部位を
いれて発色しても、この部位が入った2.8kbのものを同じベクターに入れても発色しない
ということはよくある話。だからいくつかのものを分割してオーバーラップする形で
baitを作った方が一般的にはうまくいく。
694は単なる馬鹿だから無視しろＷ
696:名無しゲノムのクローンさん
06/06/01 08:35:25
>>691
原理なんて知らなくても良い遺伝子が取れれば勝ち
697:名無しゲノムのクローンさん
06/06/01 23:00:01
>>696
勝ち負けが好きならもっと向いてる分野があるよ。
698:名無しゲノムのクローンさん
06/06/08 04:42:28
Y190使うと、IL-培養で、p15x25枚にまいて軽く10^7は突破するんだけど。
AH109を使うと、その１０分の１も行かない。
株はクローンテックのキットについてきたものを使っています。
どうしてだろうか？形質転換効率がめっちゃ低い。
699:名無しゲノムのクローンさん
06/06/08 07:53:24
漏れもAH109にbaitをtransformして、それにライブラリーを入れているんだけど
効率がめちゃ悪い。
メイティングしないと駄目なのかな？
700:名無しゲノムのクローンさん
06/06/08 09:03:50
それ、何かがおかしいよ。AH109はむしろ形質転換効率が良いことで知られている。
ＹＰＤじゃなくってアデニンを加えたYPADで培養してる？ baitにtoxicityがあったりしない？
ところで、10^7って、library DNAどのくらい使って？ IL-培養って何？
701:名無しゲノムのクローンさん
06/06/08 09:45:06
>>700
すでにbaitが入っているので、 SD 1L培養で、library50-100ugを一回の形質転換で
使っている。この方法では、Y190では問題なく行っているし、baitも同じものを
使っているので毒性の問題ではない。
702:名無しゲノムのクローンさん
06/06/08 09:48:16
どのプロトコールに従ってるかわからないけど、
ＳＤで前培養→ＹＰＡＤで本培養（３～４時間）でぐっと効率上がるよ。
この間の２回程度の分裂でのプラスミドの脱落は無視できる程度。
703:名無しゲノムのクローンさん
06/06/08 10:07:48
PEG溶液を新しくすると、おどろくほど改善することがある
704:名無しゲノムのクローンさん
06/06/08 11:04:48
50%PEG溶液って毎回作ってリフレッシュした方がいいのでしょうか？
それとも２－３ヶ月は保存可能でしょうか？
705:名無しゲノムのクローンさん
06/06/08 23:59:32
濃度が問題だから、しっかり密栓してあれば１年でもＯＫ。
チューブの口にPEGが析出するなどして水蒸気の出入りがあるなら１週間でもダメ。
706:名無しゲノムのクローンさん
06/07/26 16:34:05
こんにちは。現在5回膜貫通蛋白質の細胞質ドメインをベイトにtwo-hybridでスクリーニングをしています。
ベイトは3AT50mMでやっとバックグラウンドがおさえられたのですが、
スクリーニングプレートSD-LWH,SD-LWHAには無数のコロニーが生えてきてしまいました。
一応その中から大きいコロニーを700個拾ってきてα－gal活性を見ると、700個全て陽性という結果になりました。
候補を絞るにはgrowthcheckをすると教わったのですが、あまりにも候補が多すぎてこのまま進むべきではないような気がしています。どなたかアドバイスをお願いします。
707:名無しゲノムのクローンさん
06/07/27 08:22:58
このまま進むべきでないって判断は、経験的に言って正解です。
スクリーニングの仕方を変えた方がいいです。一番いいのは、ベイトを断片化して、バックグラウンドを生じる領域を
除いたベイトを作成することです。
708:名無しゲノムのクローンさん
07/04/04 23:29:37
こんどはじめようと思っております。
宝買収以前からClontechキットを使っている方が多いようですが、
Invitrogenと比べてどうなんでしょうか？
ざっと検討した感じではこんな感じですが、
Invitrogen- ベクターが低コピーで抑えられる、レポーターが３種類
Clontech- 売っているライブラリーが多い。
の他に違いがあるでしょうか？
709:名無しゲノムのクローンさん
07/04/04 23:48:50
迷ってる暇にサッサとやるが吉。ともかく、バックグラウンドの生えない条件で
ポジティブが出るかどうかは、やり始めてから３週間で決着がつく。
それがホンモノかどうかは、もはや酵母の実験のレベルでは分からない。
どっちのtwo-hybridのシステムが良いかなんて、エサのタンパク質に拠るし、
やってみるまで分からない。ともかく、そこは迷うところじゃない。
Clontechだって今やレポーターは３種類あるから、そこもポイントじゃない。
710:名無しゲノムのクローンさん
07/05/23 23:01:57
相互作用がわかっている組み合わせでやってみて何も出てこない。
53とTの組み合わせでは出るのでシステム自体は働いている。
シーケンスはチェックしている。-Leu-Tryプレートには生えているので、
Transformationの問題ではないし産物に毒性があると言うわけではなさそう。
フォールディングが上手く行っていないか、核にに移行していないと
いうことでしょうか？
711:名無しゲノムのクローンさん
07/05/24 08:08:15
翻訳効率が悪い
分解されやすい
立体障害で結合しない
いずれかの因子が活性化されることが結合に必要
etc.
712:710
07/05/25 00:23:33
N末C末を削ったものでもやってみたけど駄目。
他の相互作用する遺伝子をスクリーニングしようと思ったのですが、
撤退ですかね。
原因を究明しても対処できそうにはないし。
713:名無しゲノムのクローンさん
07/05/25 01:22:50
スリーハイブリットってなんですか？
714:名無しゲノムのクローンさん
07/05/25 09:25:45
>>710
てか、ホントに結合すんの？
誰かの捏造データだったんじゃ？
715:名無しゲノムのクローンさん
07/06/08 02:30:13
M2Hで網羅的解析のできる方法ってあるの？調べた限りないんだが．
716:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 00:39:35
>>710
酵母のtwo-hybridはシステムが変わると結合したりしなかったりする
酵母研究者の間では結構有名なんだけど。まあ、知らない人はしらなかったりする。
ベクター変えたり酵母を変えたりしただけで結合が見えなかったりするものなんだよ
IPとかとは違うんです
717:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 00:41:42
あっ、ちなみにtwo-hybridはがたがた言わずにとりあえずやれって授業で教わったことあるよ
718:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 01:22:38
ま、IPも擬陽性バリバリだけどな。
719:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 16:36:46
結局結合タンパク取るには何がベストなんだ？
720:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 16:43:24
>>718
おれは１０年かけてどんなものでもIPできる境地に達した。
IPはおれにまかせろｗ
721:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 17:57:11
酵母2-hybridでベイトコンストラクトがちゃんと発現してるか確認しないで使うのは御法度
イムノブロットとかでベイトコンストラクトがちゃんと予想分子量にシグナルがあるかどうか
調べた方が良い。
722:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 19:08:51
そんなことは無い。
ウエスタンで検出できる量よりはるかに少ない発現量で十分。
723:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 19:44:41
おれはクロンテックのシステムでmyc（HA？）の抗体でベイトを検出
できたことがない
724:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 20:47:53
最初,2hybridのベイトこさえて5mM 3-ATで生えてこなかった。念のためWBやったら切断されてて
DNA結合ドメインとベイトが分離していた。
リンカーを詰めて再度、ベイトをこさえたらDNA結合ドメインとベイトの合計分子量にバッチしシグナルが出た。
だがしかし、80mM 3-ATでも生えてきたよ、、、、、orz
725:名無しゲノムのクローンさん
07/06/10 21:28:56
lysate調整の時に切れたんじゃないの？＞WBやったら切断されてて
726:710
07/06/12 01:08:57
>>716
ありがとうございます。
とりあえず、Y187はあるのでそれでやってみるかな。
ベクターを変えるというのはGAL4のシステムからLexAに変えるということでしょうか？
それともGAL4で別のにするのでも意味があるのでしょうか？
>>721
ベクター変えるぐらいしか思いつきませんが、発現していない場合、
どういう対処法があるのでしょうか？
727:名無しゲノムのクローンさん
07/06/12 19:28:41
stratageneのcytotrapはいかがでしょうか。
核内と核外で普通に考えたらまったく異なる結果がでるはずですが。
経験者意見をお願いします。
当方細胞骨格系の遺伝子のy2hを考えています。
結局キットはclontechがいいんですか？
728:名無しゲノムのクローンさん
07/06/12 21:52:26
迷うよりやった方が早い。
何度も言わせるな。
729:名無しゲノムのクローンさん
07/06/13 01:10:49
俺は727ではないが。
やった方が早いとは言うけど、キット何十万もするからなあ
俺はmatch makerでいろいろとってきた経験があるからあれだが、
改良されたmatch makerは核内移行シグナルがついてるから、
cytotrapと同じ効果が得られるんじゃね？
それとも細胞質と核内じゃ結合環境が違うということか？
730:名無しゲノムのクローンさん
07/06/13 09:36:55
この人はどうしてそんなことが言い切れるのだろうか？＞核内と核外で普通に考えたらまったく異なる結果がでるはずですが。
731:名無しゲノムのクローンさん
07/06/13 11:58:52
全くということはないだろw
結局ADとBDに核内移行シグナルが付加されてるから普段核内にない分子が核に
入ってきて結合する．
だからいままで核には存在しない因子も取れてきている．
ただ微妙な塩濃度等？が影響している場合は取れない．
732:名無しゲノムのクローンさん
07/06/13 12:09:10
おまえらウダウダ言ってる暇があったら、
実際の細胞にタグ付き発現させてマス解析しろよ。
733:名無しゲノムのクローンさん
07/06/13 12:50:30
お前計画をしっかり立ててから実験しろ．
無駄な実験で人生無駄にしたいんですか？
734:名無しゲノムのクローンさん
07/06/13 23:13:58
二つのキットを比べたやつなんているか？
あれ１キットだけで50万だろ．
735:名無しゲノムのクローンさん
07/06/14 13:26:22
マッチメーカーよいよ．
クローンテックはライブラリーの質がすばらしいのでは？
SMART方は本当にすごい
736:名無しゲノムのクローンさん
07/06/14 23:36:56
クロンテックのカスタマーサービスのひどさはガチ
737:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 02:00:55
今の時代
免疫沈降やってでてきたバンドを切り出して
あるいはまとめたままの状態で、
LC-MS/MSするのがベストじゃね？
two hybridのメリットって何よ？
738:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 02:09:43
やればやっただけ時間が経つからピペット土方の暇つぶしになるよ
739:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 02:20:43
極微量しか発現しない因子も取れてくる可能性があると思うがどうよ？
素人ちゃんなんで、
大きなことは言えないが。
740:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 12:21:26
３週間（実労５日）で候補が取れること。
741:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 14:00:28
LCMSやるのにどれくらい金かかると思ってるんだ？
一つ一つバンド切り出してたら結合タンパクが多い場合
大変じゃないか？
742:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 14:26:16
ハビチュエーション因子の研究で清水先輩がLC-MSで検出したABC輸送体断片はなんだったんですか？
743:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 15:34:15
バカだなぁ。
どうせTHでものが取れたら細胞で免沈とかやって確認するんだろ、
だったら最初から免沈してマスの方が早いじゃねーか。
それに今時THで新規遺伝子取れて相互作用ドメイン決めましたとか言っても、
JBCが関の山だろ。
744:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 15:42:37
マスで取ったって改めて免沈のデータは要求されるだろが。
てか、グズグズ言ってるより論文出せよ、な。
745:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 15:48:10
マスが行ってりゃIPでウェスタンのバンドが出ないなんてことは無いだろ、１週間で出来る。
でもTHからだと、IPの実験系から組まなきゃ行けないじゃん。
746:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 15:53:52
てか、グズグズ言ってるより論文出せよ、な。
747:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 16:03:47
IPってそんなに大変か？
748:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 16:11:30
サイトトラップはホストの株をちょっといじらないとバックが酷いらしいよ。
>>747
モノによるよ。シングルIPなんかはあんまり信用されない時代だけどな。
最近はTAPtagという便利なのがあるから酵母屋さんは楽になったね。
749:名無しゲノムのクローンさん
07/06/16 21:31:52
てか質量分析やるにしてもバンドがたくさんある場合はどうするのよ？
あれってまとめてMSできるんだっけ？
マスコットサーチじゃ限界あるだろ？
750:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 00:08:17
俺プロテオミクスはあまりしらんが，LCMSMSってLCで分画を取るからなん種類タンパク質が混合さろていようが一回で解析できるんじゃね？
751:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 13:32:36
いまの流行はMudPITでしょ？
752:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 13:34:07
どっちでもいいから、論文出せよ、な。
753:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 14:04:51
>>752
revise中です＞＜b
754:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 17:46:14
mudpitって受託やっているところあるか？
受託どころか、日本で持っている研究室ほとんどないだろ？
日本だと現実的じゃないよ。
755:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 17:59:14
>>754
日本の事情はよくしらんけど理研でやってる人は何人かいるはずだよ。
アメリカでは普通にやってるねぇ。別に珍しくもなんともないよ。先週も
サンプル作ってfacilityに持ってった。
756:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 18:16:21
費用はいくらくらい？
うちは金持ちラボだが、
5サンプル出したら300万は軽く超えるだろ。
なかなか手を出しずらいよ。
757:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 18:34:43
1サンプル350ドルだったと思う。
まぁ安くはないけどね。
758:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 18:44:53
そんな安くないだろ。
俺のいるところは、
一回最低数十万はするぞ。
一時間あたり1万みたいな。
759:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 18:49:26
>>758
さぁ、どうなんだろうね。学内利用者と学外利用者で全然値段が違うらしいし
正直適正価格がどの辺りなのか、門外漢だから知らないなぁ。
けどルーチンでやってるから1サンプル数十万円ってのは有り得ないと思うよ。
760:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 19:04:05
》758
学外と学内では二割くらいしか違わないが、
大学によって格差があるんだよ。
探せば758の言うようなところ何箇所かあるよ。
高いところは設備が最新なのかもしれんが。
761:名無しゲノムのクローンさん
07/06/17 19:21:30
免沈して取れてくるタンパク質の同定なんて、
mudpit使わなくても、
nano-LC-MS/MSで十分じゃね？
mudpitは数十以上ある場合に使えばいいんじゃん？
nano-～だと何種類までオッケーなんだろうか？
762:名無しゲノムのクローンさん
08/01/13 23:30:36
全種類
763:名無しゲノムのクローンさん
08/01/14 14:12:18
誰だよage嵐してるの。
764:名無しゲノムのクローンさん
08/08/20 22:49:39
良スレage
765:名無しゲノムのクローンさん
08/08/21 21:39:31
今追い込まれながらtwo-hybridしてる…
でない…
766:水銀党SS隊員
08/08/22 01:30:22
2ハブリッドは二ヶ所のラボでやった、どっちもジャンク遺伝子しか釣れなかった
失った時間＞PRICELESS
767:名無しゲノムのクローンさん
08/08/22 02:47:09
>>765
捏っちゃえよ