01/08/03 10:14
>>98
たとえyeastの面積あたりの濃度が高いとしても、nonコロニーというのは不自然だとおもうがねぇ。
栄養が足りないと言うんなら、播くyeastの量を少なくしても、ほとんど変わらんと思う。そもそも培地が持っている栄養源が少ないんじゃないのか？
量を１オーダー間違えたとか、10xと100xを間違えたとか。
オレはプレートはセレクション完全欠損培地で固めて、あとから必要な栄養源を塗ってからyeast播いてるけど、そういう手技で、必要な栄養源を塗り忘れたっていうのなら、生えてこないのはわかるけどね。
あんまりcriticalではないと思うけど、transformation時のPEGはきちんと二回くらいTEでwashしてやろうね。それから、DMSOは買ってきたらすぐに分注して-20℃で保存。細胞保存用のだと、常温保存されていたりするものを使っても、yeastは生えてくるけど、あまりに悪いものを使うと成長に響く。
101:名無しゲノムのクローンさん
01/08/03 10:17
んでもって、どうしても生えないんなら、ポジコンのみをとりあえずやってみる。
それがでるまでやってみる。
102:1
01/08/03 11:04
うーむ、貴重なご意見どうも。
ポジコン生えないって事はグルコース入れ忘れとかいてますが、
グルコースなんて入れましたっけ？プレートに。
YPDAの事を言っているのかしら。
SD泡立った記憶がないので、量を間違えたかもしれません。
それから、ダイタイ何日くらい培養したら、コロニーになりますか？
103:1
01/08/03 11:26
しまった！！
今ちゃんとマニュアルよんだら、
SDに２％グルコース入れろって書いてあった。
100番さんどうもありがとう。
初心者以下だな。おれは。
これでもふつうの漏れキュ等ーテクニックには自信あるのよ。
104:名無しゲノムのクローンさん
01/08/03 11:38
>>102
>>ダイタイ何日くらい培養したら、コロニーになりますか？
オレは今はCG1945株とpAS2-1を使っているから、成長は遅い。どんなに遅くても、４日目にはツツケル大きさのコロニーが出現している。３日目には0.x mm程度のコロニーは電灯にかざすと確認できるよ。
105:名無しゲノムのクローンさん
01/08/03 14:52
インキュベータの中にファンがついてるタイプだと乾燥します。
水を入れた瓶をいれて湿度を保つか、プレートをラップでくるみましょう。
106:名無しゲノムのクローンさん
01/08/03 15:02
>96
プレートは、私のラボでも乾いてひび割れます。
多分incubatorの中のfanの風が強くて、プレートの中に微妙ながら風が入って、乾くみたいです。
対策法としては、プレートをキムタオル等で包んで、直接fanの風が当たらないようにすると良いと思います。
私はこれを始めてから、すぐにはひび割れなくなりました。
107:名無しゲノムのクローンさん
01/08/03 19:12
そうそう。ちょっとまえに大腸菌でのtwo-hyのキットを売り出したところがあったよね。
あれってどうなのかなあ。ぱっと見バックがすごく高そうに見えるんだけど。
やったことある人いる？
108:名無しゲノムのクローンさん
01/08/03 20:47
ちょっとめんどくさいかも知れないけど、私は酵母のプレートは
良く乾かして、使う時には酵母をまいた後、パラフィルムを巻いています。
ひび割れませんよ。
（ただし、作りたての新しいプレートだと水分が出てくるので注意してね。）
カビがコンタミしても他に拡がるのを防げますし、そのまま捨てられます。
large scaleのtransformationのときは絶対に役にたつと思いますよ。
そのままコールドルームへ入れておけば後からでもコロニー拾えますし。
プレートが乾いちゃったら死んじゃうからね。
２ハイブリッドやって長いんですけど、今のラボはプレートまきまき用の専用区画がないんで、
ベンチでやってます。それで、
コンタミを完全にゼロにするの難しいんですよね。（単にヘタクソなだけという話もありますが。）
109:1
01/08/04 08:30
皆さんどうもありがとう．
確かにインキュベーターの中にファンがついてます．
パラフィルムで巻いたりしても酸素不足にならないのかな？
今日トランスフォームしてやり直します．
みずいれた瓶いれてラップで防御しよう．
110:名無しゲノムのクローンさん
01/08/04 12:46
>>酸素不足
ならないですね。スクリーニングに使う程度の期間なら。
111:名無しゲノムのクローンさん
01/08/04 17:56
108です。
酸素不足が心配？いやーその気持ちよくわかります。
でも大丈夫ですよ。酵母のラボ何研究室か見ましたけど、
みんな平気でビニールテープ巻いて密封したりしてましたし。
ファンのついてるインキュベータ持ってるなんてうらやましいです。
ひょっとして冷却機能もついてるやつですか？いいなー。
（でも2hybrid screeningだけなら無くても実験できるよ。）
水を入れるのは私もやったことあるんですが、
こっちはメンテナンスが面倒臭いんですよ。
カビの原因になるし。
なにはともあれ、今度はうまく行くといいですね。
112:名無しゲノムのクローンさん
01/08/04 19:56
うーん、臨場感あっていいなあ。あげ。
113:名無しゲノムクローンさん
01/08/04 21:36
>111
カビ困るよね。汚く使う人と一緒はいやだけど贅沢いってられないし。
114:名無しゲノムのクローンさん
01/08/05 00:46
酵母は無気呼吸もできるから、酸素不足は心配しなくても大丈夫だよー
115:名無しゲノムのクローンさん
01/08/13 11:29
>>1
two-hybrid どうなってんの？
116:名無しゲノムのクローンさん
01/08/13 15:03
さてはお盆休みか？
117:1
01/08/13 20:09
いや、実はあんまりうまくいかないもんだから黙ってたんだが、
生えてこないんだよねえ。
よく考えたら、区論テックのSDminimum baseって、
sugar最初っからはいってんだよねえ。
ばいちかえて蒔きなおしても生えてこないんですよ。
ペースト状にうっすらと生えてるように見えるんですが、ひょっとしてこれって
生えてるの？
そうはおもえないんですよねえ。
やっぱり大腸菌しか使ってないラボでやるのは大変だ。
こんどこうぼやってるラボに聞きにいってきます。
ちなみに今ほかの実験もやってるので、怠け者だと思わず、温かく見守ってください。
118:名無しゲノムのクローンさん
01/08/13 23:51
>ペースト状にうっすらと生えてるように見える
検鏡するとどう？ やたらと小さいモノが見えないかな。
いずれtwo-hybridには無用のブツな気がする。
transformはどうやっていますか？
119:名無しゲノムのクローンさん
01/08/15 07:08
Li法なら冷やすの禁止
120:名無しゲノムのクローンさん
01/08/15 07:13
「two-hybridでまさに今人生を棒に振っています」
っていうスレタイトルに変えるか？
121:1
01/08/15 13:08
人生棒にか。
そうなったりして。
ていうか、人生棒に振るくらいの覚悟でやんなきゃだめかな？
サブの実験だからって手を抜いちゃだめだな。
transformationは、クロンテックのマニュアル法です。
よく分からんが、PEG-LiACとかつかうやつ。
冷やすの禁止って、集菌してる時とかに？
今日アポ取ってもらった。酵母やってる人に。
一応聞いてくる。
122:名無しゲノムのクローンさん
01/08/15 14:47
"気楽"に実験やるのは、再現性のある結果出す上でも大切なこと。ただし、手を抜くのとは違う。
毎回手を出す新しい実験に、人生かけてたらいくら人生あっても足りない。
PEG/LiAc法はフツーのyeast transform法。
ペースト状ということは、yeastはいるんだと思うよ。ただし、transform成功してないと感じるが。プレートを直接見ているわけではないから、語弊があるかもしれないが、そのペースト状になっているところから、transformantがコロニーを形成していく。コロニーを形成しないということは、plasmidがきちんと入っていないんだよ、多分。
yeastがいるかいないかくらいは、酵母をいくらやったことがないといっても、判断できるのでは？ yeastいるのに、生えてこないのなら、選択培地を間違えているか、transformationに失敗しているかといったところだろうな。プレート上にyeastがいるのかいないのか、それ確認するの大切だと思うが。
123:名無しゲノムのクローンさん
01/08/15 14:50
冷やすの禁止はわかるが、かといって、数コロニーも生えないというのは、冷やす冷やさないが効いているとは、解釈しにくい。
以前、4℃で集菌したことがあるが、生えるのは生えてくるぞ。
124:ほふ
01/08/15 19:35
ぽじこん・ねがこんはどう？それと比較した結果を教えてよ。
125:1
01/08/15 20:28
みなさまありがとうございます。
コウボやってる人に尋ねてきましたが、
解決法いまだ判別しませんでした。
今度は、heat shockした後に、YPDAで回復期間を設けてやって見ます。
ちなみに、こないだも書きましたが、ポジコン、ネガコンともに
生えてきてません。
だから、培地が違うかなんか入れてないかだと思います。
もう一回やってできない場合は、そのラボに出張してやってきます。
ちなみに、現在、two-hybrid以外に、
in situ,knock-out screening,epigenetic mutant の検出、
植物の形質転換等をいたしております。
こちらのほうは順調なんですが。
やはり、初体験の実験で、自力でやるのは大変ですよね。
cDNA library作ったときは、３回目にしてようやく６００万pfu
の良質なものを作ることができました。
126:名無しゲノムのクローンさん
01/08/15 21:26
>transformationは、クロンテックのマニュアル法
HSの後の冷やしは省略して、速やかにR/Tで遠心が吉。
127:1
01/08/15 21:39
>>126
今日聞きにいったところの人もそんなことおっしゃってました。
どうもありがとうございます。
あと、素性がばれるといけないので、みなさんなるべくsageてくれると
ありがたいです。
なんか進展があればあげます。
128:名無しゲノムのクローンさん
01/08/16 01:32
つかってるPEGの分子量はいくつ？
以前、初心者の人で6000のを使って「生えてこない」と困ってるのを見たことがあるので。
ちなみに私は3350でやってます。
HSの後冷やすの良くないとは知りませんでした。
4℃の遠心器使ってるけど、5秒しか回さないから影響なかったんだろうなあ。
129:名無しゲノムのクローンさん
01/08/17 02:27
1は漏れキュ等ー手クニックに自信があるそうだから
試薬、培地、プラスミドは当然チェックしただろう。
125、プレミックス培地に責任転嫁すな（本当に不良ロットだったらｽﾏｿ)。
手技を疑え。操作を手早くすれ。
初心者は操作に不慣れなためにインキュベーション時間を延長しがちだ。
でむそは用が済んだら即覗け。
128は時間をかけないところが良いのでは。１は他のじっけんがんばってください。
130:名無しゲノムのクローンさん
01/08/17 20:17
ぺぐそ
131:名無しゲノムのクローンさん
01/08/20 02:11
すみません。私もヒートショックのあと冷やすのが良く無いとは知りませんでした。
いつも氷水で急冷してから、４度で１０分も遠心してました。
もしよろしければ、どなたかなぜいけないのか教えていただけないでしょうか？
ひやすことで、どれくらい悪影響があるのか御存じでしたらそれも教えていただけると
有り難いです。
ちなみに私の手技では形質転換効率は５x１０（４）cfu/microgram DNA程度です。
132:sage
01/08/20 02:12
sage
133:名無しゲノムのクローンさん
01/08/20 20:48
>>131
細かいことはフォローできないが、細かいリクツは説明つかないのでは？ transfectionの手技自体、リクツあってないようなもの。
行き着くところ、結果オーライで、～10^4のefficiencyなら、問題ないのでは？
いや、HS後の冷却がダメだとか、意味がないと言ってるんじゃないよ。
134:名無しゲノムのクローンさん
01/08/20 20:55
１の場合は、heat shock後の冷却が中心に効いて上手くいかないのではないとおもう。オーダーが下がるっていうんなら話はわかるが、生えない、ボジコンも生えないっていうのは、基本的な手技を疑った方がいいとおもう。
YPDで回復させるというのも、効果としては低い気がする。私もyeast扱い始めのころに、同時に複数のサンプルのtransfectionやって、相当メチャクチャしたけど、一応、基本的なプロトコールに従って出来た。
ちなみに、この指摘もあまり意味がないと思うが、DMSOは新しいのを使っているよね。細胞凍結用で常温保存しているヤツなんかを、無菌だからと培養やっている人から分けてもらったりすると、効率のオーダーが下がるときがある。
135:名無しゲノムのクローンさん
01/08/20 21:02
酵母を４℃に入れると、眠りに入る。
やってみればわかるが、４℃に一週間から二週間放置した株と、30℃に入れておいた株と、同時に培養スタートすると、30℃の株の方が成長はやい。
それと同じで、熱ショック加えたあと、冷やしすぎると、酵母の元気がなくなるということでいいのでわ??
136:名無しゲノムのクローンさん
01/08/20 23:38
本筋ではないのですが、ぺっとりしたペースト状の「何か」が生えた経験を
お持ちの方はいらっしゃいますか。１さんの描写のような何かが私のプレートでも
生えたことがあります。別のラボでも見ました（結局screen自体はうまくいって、
謎が未解決のままです）。現役の臨床検査技師さんの見立てでは
「バクテリアではないみたいだけど...」で、酵母ではない研究者の方は
「酵母か死んだ酵母だと思うけど」とおっしゃいました。
コンタミでなければ酵母から派生したと考えるしかありません。
そんなこんなで、たまに「死んだ酵母が増殖して」いたのでした。
これっていったい何だったのでしょう。情報求む！
137:名無しゲノムのクローンさん
01/08/21 01:35
酵母two-hybrid用にもらったvectorがBSだったことがあったな。
何も生えてこなかった...
138:酵母屋ではない人
01/08/21 10:48
>>136
意味がイマイチわかりにくいんだが、とりあえず「死ぬ」という表現は適切でないだろう。
確実に増えている、それもセレビジエなら、出芽している様子が検鏡で観察できるのかな？ 派生したというのも、「自分で形質転換した」という解釈ならまだわからんこともないが。
139:名無しゲノムのクローンさん
01/08/22 00:36
新鮮なＰＥＧとＤＭＳＯ
３ＡＴもロットによってばらつきがかなりあるので、できればメーカーに
データシートをもらって純度を見た方が無難
純度の高いライブラリー
確実で手早い操作
ＨＳの時間
プレートをインキュベターの中で乾燥させないように・・
気をつけてるのはこのくらいです。
でも気がつくのに凄い時間かかりました。
一人で立ち上げるのは大変なのでがんばって下さい。
140:名無しゲノムのクローンさん
01/08/29 23:40 8PlKKeZw
1はまだ挫折してなかろうな？
俺はこれでTFの効率が一気にあがった。
「The Gietz Lab Yeast Transformation Home Page」
URLﾘﾝｸ(www.umanitoba.ca)
141:名無しゲノムのクローンさん
01/08/30 16:55 5u0ob7C.
>>140
ｵｵ。
142:名無しゲノムのクローンさん
01/09/04 00:01 43SmxSgo
yeast扱っていない人にプレート見せるときは気をつけよう。
大腸菌の感覚で、ほいっとふたを開けられるときがある。
コンタミ確率100パーセントでないにしても、やはり気持ち悪い。
143:名無しゲノムのクローンさん
01/09/12 04:19
結果気になるのであげ
144:名無しゲノムのクローンさん
01/10/16 00:59
re-age
145:名無しゲノムのクローンさん
01/10/16 04:48
結局1は、はまって終わったのか？
146:名無しゲノムのクローンさん
01/10/16 12:58
そういえば、昔やり始めの頃酵母の株を変えてみたらできた事がある。
まえ、区論テックの株を使っていたら出なくて、酵母をやっているラボから貰った株を使ったら一発で出た。
もちろん、株そのものの問題より、それを管理する能力の差だったのかもしれない。
そういう経験ってない？
147:ｄ
01/10/16 22:19
株に関しては、変異が入ることはまず考えられない。
しかし、genotypeが維持されているかどうか確認したほうが良い。
使おうとしている株が、本当にその株かどうか確認しなさい。
多分違うんだよそれ。
ほかから株をもらいなさい。
148:名無しゲノムのクローンさん
01/10/24 09:25
あげ
149:名無しゲノムのクローンさん
01/10/24 20:33
区論テックのマッチメーカー３は何故か区論テックの培地で無いと生えんかったが細工でもしてるんでしょうか？
ちなみにAH109です。
150:名無しゲノムのクローンさん
01/10/24 21:05
俺もAH109使った時はあんまりよくなかった。
YPDでは生えるのだけど、選択培地ではポジコンが生えなかったことがある。
それ以来使っていない。
151:名無しゲノムのクローンさん
01/11/01 23:51
あるbaitでbackが異様に高くなる現象は、どう考えればよいのでしょうか。
もちろん、コンタミしていないという前提ありでなんですが。
152:名無しゲノムのクローンさん
01/11/02 03:21
>>151
baitの配列に酸性アミノ酸が多いとかの理由で、bait自身に
転写活性化能力がたまたまでちゃうとか。
153:151
01/11/03 00:10
んー。同じドメインをもつ別のタンパクではそんなことないんですよねえ。
なんでなんだろ。
154:名無しゲノムのクローンさん
01/11/03 02:16
同じドメインもってても、アミノ酸配列が全部同じなわけじゃないし。
諦めて、別の領域をbaitにしましょう。
155:151
01/11/03 02:38
ですねえ。もうちょっと３ＡＴとかで粘って、だめだったらあきらめるのも
視野に入れないとですね。
156:名無しゲノムのクローンさん
01/11/10 02:44
next?
157:名無しゲノムのクローンさん
01/11/10 12:58
ストラタのbacteria-basedのtwo-hybrid、試したヒトいない？
158:名無しゲノムのクローンさん
01/11/11 00:43
>>151
yeast内部での発現baitを解析してみた？
あとは、baitのみのtransfectantをシングルコロニー化して各コロニー間で差が出るのかでないのか？
コンタミとはいわんが、クローンごとの差が反映されやすいことはあるかもしれない。
159:151
01/11/12 01:39
>>158
ええと、それはWesternということなんでしょうか？いちおうタグをつけた
重要だとみなしているbaitとつけていないbaitがあるのですが、酵母のWesternは
少し難しいと聞いており、少々二の足を踏んでいる状況です。
後者の、baitのみのtransfectantは、一応チェックできているはずです。
というのもbaitとpreyを２回にわけて入れる方法をとっているというわけなのです。
クローンごとの差というのは、もちろん感じております。また、それが素人ゆえの
実験操作の不手際さであらわれているのかという不安もあります。ただ、何度か
（５回くらい？）行った感触からして使いづらい傾向（backが高い）が現れている
のは否めません。
160:名無しゲノムのクローンさん
01/11/13 19:05
日常的に酵母からタンパクとってます。
特に難しくはありません。
気をつけるのは、細胞壁を壊す必要があることとlog phaseの細胞を使うことくらいでしょうか。
回収目的がウェスタンだけだったら、かなり気楽にできます。
ところでウェスタンを使わないチェックはどうやってるのでしょうか。
栄養要求だけですか？
baitのみのtransfectantsの各クローン間で差が出るのは腕とは関係無い気もしますが。
これはbaitのみのtransfectantsのウェスタンをすればはっきりすると思います。
それからHis要求での選択の後、Adeとかの栄養要求でも一回選択できます？
できるんだったらとりあえずやってみるのも可かと。
161:151
01/11/15 02:08
そのbaitに対するポジコンがあれば、もちろんそれを用いればよいのでしょうけど、
ぼくの実験はlibraryからのscreenなのでこの方法は使えませんね。
やっぱり、westernがbestな方法なのでしょうね。きっと。
162:名無しゲノムのクローンさん
01/11/16 22:50
baitの発現がWesternで確認されなくても、スクリーニング成功したよ。
だいたい、reporter遺伝子の上流にくっつくだけ発現してりゃあ良いんだから。
あんまりbaitが高発現だと、prayの発現が悪いとdominant negativeに喰っちゃ
うことだってあるんじゃない？
163:151
01/11/17 01:34
>>162
そうなんですよね。baitのβ-gal活性がないのに、preyを入れたときに
backが高くなるということは、baitの発現が高すぎるという原因もあるという
ことに気づきました。
ただ、preyの発現が悪いというのは相対的なものかもしれません。というのも、
別のbaitでpositive cloneが取れてきたため、実験系自体が悪いともいえない
ような気がしてきたものでして。
>>160
Adeの栄養要求というのはpreyのplasmidに組み込まれている場合ということ
ですか？
もしそうなら、それは出来ないです。
そうでないなら、どのような方法があるのでしょうか？
あと、思うこととしてbait同士がdimerを形成する場合というのはどういう結果と
なるのでしょうか？文献からこの線も捨てきれない事情があります。
この場合、BD-BD-ADとなったりする可能性はあるのでしょうか？
もしあるとすれば・・・、いや、あったとしても、backが高くなる理由には
ならないかな。
164:名無しゲノムのクローンさん
01/11/17 03:27
Hisの他にAdeの栄養要求性でbaitとprayの結合を見れる菌株があるのです。
Adeでselectionすると、ほとんどbackはでません。
私はいつも、-Hisで選択した後-Adeにレプリカして、両方で生えてきたやつを
positive cloneとしています。
ちなみに私、baitの発現チェックなんてしません（爆）
backがどの程度あるかだけはチェックしますが。
165:名無しゲノムのクローンさん
01/11/18 10:23
three-hybridやってるひといる？
166:名無しゲノムのクローンさん
01/11/18 22:23
>>159
YeastのWesternが特に難しいということは無いですね。
>>160氏のように、普通のタンパク抽出の方がWesternよりも気をつける面が多いと思いますよ。
Western用のタンパク抽出の場合、きちんとProteinase InhibitorかましてSDS-Ureaで変性下で細胞砕いてやるというだけです。
それから、タグってどういう意味なんでしょう？ Anti-DBD/Anti-ADで落とせば、つないでいるものに関わらず、原理上、Westernで確認することは出来ます。
>>BD-BD-ADとなったりする可能性はあるのでしょうか
立体障害の点がクリアできているのなら可能性はあると思いますね。
当然、BD side Dime形成でinteraction siteが隠れてしまうとかはナシですが。
>>162
>>baitの発現がWesternで確認されなくても、スクリーニング成功したよ。
要は何を持って「screeningした」と結論するかということ。もちろん、Westernで確認できたからscreeningが成功したとは結論付けられないはずですね。
単純にいくつかのバリエーションとしてのクローンとって、あとは別の系で検証するのなら問題は無いでしょうが、two-hyである程度までの結果として取り扱っていこうというのなら、後ろ盾は取っておくのが賢明でしょうな。
結果が出たなら、まぁいいけど、151さんのように何が悪いのか分からないなら、色々堀を埋めて行くことも大切ですよね。
167:名無しゲノムのクローンさん
01/11/18 23:08
つーはいって、適当にいろいろなベイトを試してうまくいったら
喜ぶっていうスタンスじゃダメなの？
ほとんど作業はないし、合間にやるものじゃない？
168:名無しゲノムのクローンさん
01/11/23 04:24
>>157
ストラタのbacterioMatch，
使ってみたけどcarbenicillin選択がうまくかかりません。
yeastやin vitroで結合が確認された組み合わせもポジティブになりません。
もちろんyeastでのアッセイ同様，蛋白質によるんだろうけど，
すくなくとも私の研究には使えそうにないな。
169:151
01/11/23 23:17
いろいろと考えた結果、Ubiquitinなどのgeneralなendoの結合タンパクが
くっついているためbackが高くなるのではないかと思い始めました。
例えばUbiquitinならば、
Ub-Ub-(n)-Ub
／ ＼
BD AD
binding-site Pol→
----------------------------------------
みたいなかんじで。だから、β-gal活性は低いけどcolonyとしては
現れるのではないかと。
下手な図で申し訳ないです。
170:151
01/11/23 23:19
うーん。図がうまく書けてない。。。
171:151
01/11/24 02:14
>>169
もとい、
binding site-BD-Ub(n)-AD→Pol
みたいに、直接にBDとADのinteractionではなくということです。
172:名無しゲノムのクローンさん
01/12/24 15:12
ストラタのbacterioMatchですが、全く役に立たないです。というのか、あれで
うまくいった人っているんですか？代理店サイドでも調査が始まったそうですが・・・。
173:名無しゲノムのクローンさん
01/12/24 15:23
酵母のたたりだよ。
174:名無しゲノムのクローンさん
01/12/24 15:32
Two-hybridして陽性のクローンが出たら、
その次はやはり、in vitro binding assayして調べなきゃいけませんか？
175:名無しゲノムのクローンさん
02/01/06 04:56
で..1さんの実験はどうなってるの？
176:名無しゲノムのクローンさん
02/01/08 16:00
僕もこれからTwo-hybrid立ち上げようと思うのですが、
膜タンパクでは適用できないって聞いたんですけど、
本当ですか。誰か教えてください。
177:名無しゲノムのクローンさん
02/01/08 18:41
陽性のクローンなんて出まくりだよ。
でもほとんどが、疑陽性。
これをふるい落として、意味のあるbinding蛋白を選んで、そこからまた次に繋がる実験をするのは、やはりなかなか厳しいものがありますよ。
CO-IPやGSTpulldownは必須ですが、その次じゃぁ何をするかということになりますからねぇ。
死々累々の実験ですから、これをmainにやっていくのは、要注意。結構、撃沈する院生が多いです。
178:
02/01/08 19:04
最近もcellやnatureのペーパーでtwo-hybridのデータあまりみないね。
ほとんどがIP～mass spectrometryになった。
179:名無しゲノムのクローンさん
02/01/08 22:43
>>176
そりゃー、核に移行してくれないbaitでは、原理的にできないでしょう。
Rhoとかでtwo-hybridする時は、ミリスチル化される部分を除いてるはず。
180:名無しゲノムのクローンさん
02/01/11 00:03
>>178
そうでもないよ。もはやあんまりあたりまえの技術だからなんだろうけど、Cell
みたいにスペースの余裕がある論文でも、two-hybridで取ったとしか触れられな
くなってるけどね。何と言っても、とりあえず何も考えない奴でも始められるの
で、裾野が広いのが強みでしょ。
181:名無しゲノムのクローンさん
02/01/11 05:53
で１の実験はどうなってんの？
182:名無しゲノムのクローンさん
02/01/22 06:42
>177
どーやって意味のあるのを選べばいいの？
183:名無しゲノムのクローンさん
02/01/22 15:51
>>177
phenotypeに戻りましょう。
遺伝学的データがサポートされていれば、
Goでしょう。
184:名無しゲノムのクローンさん
02/01/22 18:55
はじめまして。面白いスレですね。ちょっとかきこします。
クロンテックのtwo-hybrid system 3とpretransformed libraryを
つかって、なんとかスクリーニングまでたどりつきました。
酵母は周りにやってる人がいないのでかなり不安でしたが、一応
ここまではマニュアル通りに動いてます。
しかし、なんだか陽性クローンが２００個くらい出てきそうな様子
で、正直な所途方に暮れています。これら全部restreakして調べる
べきなんでしょうか。みなさんはどうしてらっしゃいますか？
185:名無しゲノムのクローンさん
02/01/24 01:52
とりあえずre-streakだけしといて、20個くらいずつ
プラスミド回収して解析していく。
絶対おんなじ遺伝子がいっぱいとれてきてるはず。
そのうち新しいのはでてこなくなるからそこで止め。ってのでどう？
いや、面白そうな遺伝子が取れた時点で止め、ってのでもいいんだけどね（笑）
186:名無しゲノムのクローンさん
02/01/24 12:21
200くらいだったら少なくとも何がとれたかくらいは一ヶ月くらいでできるので、
それこそ面白いやつだけやるってかんじでしょうね。
でも、やっぱりジャンクは多いですけどね。
187:名無しゲノムのクローンさん
02/01/24 12:26
>187
おれも同じような状況に陥った。
188:名無しゲノムのクローンさん
02/01/24 12:27
×187→○185
189:名無しゲノムのクローンさん
02/01/24 13:14
>184
200クローンぐらいなら、少しがんばれば、yeastからplasmid取り出して、大腸菌に入れなおして、またplasmid取り出せるはず。
そのplasmidを、すべてシークエンスして、dataを集めてからが、本当の試練。
enzymeで切って、流して、泳動パターンを見て、同じクローンかどうかを判断するのは、意外と難しいと思います。
気合を入れて、キアーゲン＆シークエンスマシーンにしばらくなるべき。
190:184
02/01/26 16:50
>185-189
アドバイスどうもありがとうございます。
とりあえずひとまず全部フリーズストックして、何回かにわけて
全部シークエンスに持ってこうと思います。
（臨床系の人間なので、時間と設備が結構限られてしまうので
全部一気にやるのはきびしそうなので、、）
191:名無しゲノムのクローンさん
02/01/26 16:58
>>190
僕もつい最近、系を立ててやってます。
実際、４００クローンほど、１次スクリーニングで
取れて来ました。
とりあえず、２０クローンぐらい先に進めて（curing retransformation等）、
シークエンスしてみて、同じのが取れて来そうだったら、
残ったクローンはそのインサートに対して
colony PCRかけようかと思ってます。
192:名無しゲノムのクローンさん
02/01/26 18:10
>>191
libraryのマーカーがLEU2だったら（っていうかLEU2以外のlibraryって無いと思うけど）
curingするより、HB101とM9-Leu培地を使って LEU2 plasmidをとった方が早いよ～
どうせリトラは必要なんだし。
193:名無しゲノムのクローンさん
02/01/26 23:21
>>184
クロンテックのpretransformed libraryだったら少なくとも１回大腸菌で
増やしているので、コロニーPCRと制限酵素処理でおおよその見当がつくでしょう。
どの酵素だったか忘れましたがPCR産物をダイレクトに処理できるはずです。
多く検出される遺伝子をシークエンスすれば良いでしょう。
>>176
核移行できないものならCytoTrapでやってみたら？
194:184
02/01/27 00:42
＞193
良く知らないのですが、yeastでもcolony PCRって
できるんですか？glass beadsとか使って壁破壊して
からということでしょうか？？
195:名無しゲノムのクローンさん
02/01/27 04:39
>>193
CytoTrapってSos-Rasを利用してるっていう奴ですか？
なんかまともに動かないという噂を聞いたのですが、どうなんでしょう？
（あ、私は176じゃないです）
>>194
確かglassbeads使わなくても出来ますよ。
詳しいやりかた忘れたけど（＜役に立たねー！）
まあ、roughにでもplasmid回収してからのほうが確実ですけど。
196:＞１９５
02/01/27 05:32
私も似たような噂を聞きました＞CytoTrap
197:193
02/01/28 00:20
>>195
菌株の関係でfalseが出やすいみたいですけど、どのみちCo-IPで確認するわけなので、
通常の系で出来ないものを試すにはいいのでは？
colony PCRは滅菌水に縣濁してboil、それをテンプレートにして行う。
昔の大腸菌colony PCRと同じ。最近大腸菌は反応液に直接縣濁してるので。
198:195
02/01/28 02:04
>>193
falseが出やすいって、リバータントが出やすいってことでしょうか？
（菌株はcdc42-tsでしたっけ？忘れましたけど）
ただ結合をみるだけならともかく、スクリーニングにそういう菌株は辛いような。
結合見るだけならそれこそco-IPだけでいいと思いますし。
baitのマーカーがURA3なら、5-FOA使えば何とかなるかもしれませんが・・・
199:名無しゲノムのクローンさん
02/01/28 09:03
知ってるDrが、Sosを使った系でコロニーが計１０００個ぐらい
でてきて、restreakして残った（？）５００個を全部調べて
どれもノンスペだったとかいってました。
なにをどうやったのかは知りませんが。
200:名無しゲノムのクローンさん
02/01/29 14:07
９月からtwo-hybridを動かしている者です。
クロンテックのGAL4のsystem3とpretransformed libraryを使ってます。
何とかMatingまでこぎつけてscreeningをしたんですが、
SD/-Ade/-H/-L/-Wの培地でコロニーが600個ほど出てきてしまいました。
それで今のところ50個くらいを解析したのですが、ほとんど同じクローンが拾えてきません。
何かやり方に問題あるのでしょうか？
Help求むです・・・。
201:名無しゲノムのクローンさん
02/01/29 16:44
>200
やり方に問題があるのではなく、two-hybridがそういうものなだけです。
200,300個くらいシークエンスすると、多分いくつか同じシークエンス（もの）が出てきますが、出現頻度が高いイコール重要 ではありません。
ここらへんが、two-hybridで、死者が続出する原因だと思います。
202:名無しゲノムのクローンさん
02/01/29 20:32
two-hybridやって塩基配列解読して関連遺伝子が無いときって皆様どのように対処してます？
203:200
02/01/29 23:03
結局two-hybridで多くの種類のクローンがつれてきた場合、
true positiveとfalse positiveの判別はどのようにやるのが一般的なのですか？
細胞工学のtwo-hybridの特集で頻繁に見られるfalse positiveのクローンがリストになっていたと思いますが、
それを頼りに判断するのでしょうか？
スクリーニングを初めてまだ１ヶ月ほどですが、はやくもげんなりです（汗）。
204:名無しゲノムのクローンさん
02/01/30 01:25
>>200=203
re-transformしてOKならco-IP。それでOKなら大抵信じてもらえます。
あと、いかにもノンスペでとれてきそうな遺伝子はとれてきてますか？
HeatShockProteinとかribosomal protein とか。そういうのがとれてきてたら
多分系自体は動いてるとおもいます。
ところで、false positive クローンのリストっていつの号に載ってます？
>>201
出現頻度が高いイコール重要ではない、ってのはわかりますけど、
結合の強いやつって大抵たくさんとれてきません？
>>202
わたしは酵母の人なので、とりあえずつぶしてみて、phenotypeが
bait つぶしたときのと同じならGOですかねぇ。
phenotype がでなくて捨てた遺伝子も多数あり。
って two-hybridスクリーニングに限った話でもないですが。
205:200=203
02/01/30 16:00
解析していて出てくるのは確かにHeatshock proteinとかも出てきますが、
他に良く出てくるのは酵素関係のものです。
それ以外にもBACクローンとかRIKENのものとか固有名詞？がないクローンもでてきます。
false positiveのリストは細胞工学の2000年のVol.19とVol.20にのってます。
やはり解析を続けるべきでしょうか？
206:名無しゲノムのクローンさん
02/01/30 16:26
黙って免沈しろ。
207:名無しゲノムのクローンさん
02/01/30 21:39
陽性疑いのクローンが出来てきたら、yeastでのmating assayで、擬陽性をふるい落とすのもお勧めです。
baitの発現vectorのみや、同封されてるネガコンのvectorのみとも、拾ってきたクローンが反応して、アミノ酸欠損培地でコロニーが生えるようなら、擬陽性と思われます。
ようするに、クローンのタンパクと反応せず、tagやGAL4等と反応してるということですから。
IPは必要ですが、数十から数百クローンに対してやるのは、非現実的ですから。
208:名無しゲノムのクローンさん
02/01/31 04:00
>>200=203
難しいところですねぇ。酵素関係か。bait遺伝子の機能とは関係なさそうなんですかね？
取れてきてる名無し遺伝子がちゃんとin frame になってて、ある程度の
アミノ酸長があれば、それを解析していくという手もありますが。
でも、これってはまるパターンでもあるしなぁ・・・
ところで、念のために確認しますけど、re-transformはしてますよね？
207さんも書いてますけど、GADと反応するようなタンパクもとれてくる可能性も
あるので、回収したクローンをもう一度 baitの発現vector または bait と
co-transform しなおして、bait とco-transform したときのみ HIS+, ADE+ に
なることを確認する必要はありますよ～。
私はいつも co-transform で確認してますけど、
207さんの書いてらっしゃる mating assay でもいいと思います。
209:名無しゲノムのクローンさん
02/02/05 21:07
ストラタのバクテリアTwo-Hybridやってます。
酵母よりも慣れてるので手を出しましたが、苦労が多い。
カルベニシリンは800μｇまで上げてやっとスクリーニングらしくなりました。
添付の陽性コントロールだと確かにこれでも生えてきて青くなるので、
システムは一応働いていると信じて続けてます。
今のところ1次で約100個、これが２次で全滅、やり直し中。
ただ、宣伝文句と違って、プラスミドに毒性が高いらしく
30度培養でゆっくりとしか生えて来ず、大腸菌のくせに全然スピードアップにならない。
コピー数が少ないらしくプラスミドの回収率が極端に悪い。
Transformationの効率が悪く、プロトコールどおりで10+4オーダーしか入らず、
10倍以上のスケールが必要で、５万円の別売りコンピテントセルがあっという間になくなる。
試しに自分でコンピテントセルを作ったり、エレクトロポレーションも試して見ましたが、
自作だと全然入らない。
良く考えてみると、いつもは大腸菌には1つだけプラスミドが入って形質転換されると
信じてサブクローニングなんかしていましたが、Tow-Hybridみたいに1つの大腸菌に
2種類のプラスミドが入ることは可能なんでしたっけ。
ひょっとして５万円のコンピテントセルが作り出したノンスペか？
そこで、どなたか知ってる方お教え下さい。
大腸菌に2種類以上のプラスミドを導入するコンピテントセルは作製可能でしょうか、
その作り方はどんなのでしょうか。
210:名無しゲノムのクローンさん
02/02/05 21:44
ストラタのキットは大問題になっています。
211:名無しゲノムのクローンさん
02/02/05 21:46
>209
自作のコンピテントセルだと製品の半分くらいの効率で入ったよ。re-transformなんかでは使える。作り方は培養を低温でする普通のやり方だけど。
212:名無しゲノムのクローンさん
02/02/09 01:23
>>209
Baitをあらかじめ入れた改変ハナハン・コンピでは形質転換効率はそれほど
悪くなかったですよ。ただ、やっぱりスクリーニングはだめでしたけど。
ネガティブコントロールも少し培養が長いだけで青くなります。（メーカーからは
すべてのコロニーが青くなる前に（差のあるうちに）スクリーニングしてくれ
との解答がきました・・！）
青くなる前にスクリーニング
213:名無しゲノムのクローンさん
02/02/09 01:34
ベーＧＡＬとか免沈とかやる前に取れてきたものは全部シークエンス
しちゃう。それが一番速い気する。
金かかるけど。
214:名無しゲノムのクローンさん
02/03/03 13:31
1の最新情報希望
215:名無しゲノムのクローンさん
02/03/03 13:45
>>213
賛成。シークエンスは昔のように苦労も金も少なくて済むようになっている。
216:名無しゲノムのクローンさん
02/03/05 19:27
>>212
自作のコンピしか使わなかったけど10^6ぐらいでてたよ。
とにかくtargetがろーこぴーだから、seqenceにやたら時間がかかった。
incubationがo/nなだけで、合計時間はyeastと大差ないと思う。
おまけに取れてきたものはUTRやらinvertやらごみばかり。
baitの大半があぐってるし、targetもあやしいから当然の結果なのかな。
217:名無しゲノムのクローンさん
02/03/05 22:27
バクテリアでGSTやHisタグ付けたタンパク質を発現しようと思っても、結構な
確率でアグって使いものになんないのに、ライブラリー入れてスクリーニング
なんて出来るのかね、大体。
218:名無しゲノムのクローンさん
02/03/05 22:43
ストラタのキットの成功例ってないの？
219:名無しゲノムのクローンさん
02/03/06 09:39
ぼくストラタで大成功
１ぬけた！！！
ハッキリ言ってCELL狙ってます
220:名無しゲノムのクローンさん
02/03/08 22:55
＞２１９
なんか間違ってんだよ、それ。
221:名無しゲノムのクローンさん
02/03/14 03:47
1は？
222:名無しゲノムのクローンさん
02/03/14 20:36
＞１
日記なんだったら毎日書きなよ。いろんなアドバイスももらえるしさ。
223:?@?@
02/03/14 22:18
1はあめりかにいったから、もう２ｃｈ見てないみたいよ。
丁度、夏の２ｃｈ閉鎖危機の辺りに行くことになって、
かきこめなかったんだって
224:名無しゲノムのクローンさん
02/03/14 22:49
1ってどこの人だったの？
225:あほさん
02/03/15 04:39
うちのラボの助教授は5年間位、スクリーニングを続けてる。
ここ2年はtwo-hybridで。
取り合えず、手を動かしてるから研究してる気になってるが、
あまり価値なし。
とれた遺伝子の機能解析を全く行っていない。
なのに、研究者として優秀だと勘違いしてる。
東大出身だと自分の負けを認められないのかな？
こんな阿呆みたいなスタッフは他にもいますか？
226:
02/03/15 12:02
どこにでもいるだろ
227:名無しゲノムのクローンさん
02/03/15 14:16
＞２２５、２２６
うちにもいるよ。くそにもならん当代出身のババア助手が。
昼ごろ出勤してきて、夜８時には帰る。その間なにをしているのかよくわからない。
実験はしない、やってても遅いうえに何の実験やってんだか。つかえねえデータばっか出しやがる。
そのくせ他人のデータにはケチをつけ（そのケチの付け方も的外れ）、教授助教授には迎合し。。
僕と一緒にやろうということになった実験はナーナーになって先延ばし。業を煮やした僕が「いい加減始めないと。。」というと『じゃあ自分で勝手
にやればあ！？」と逆ギレする始末。
僕はマジでキレてます。今は口もきいてません。
228:名無しゲノムのクローンさん
02/04/02 19:24
酵母の中ではリン酸化は起きないの？
229:228
02/04/02 23:50
なんだ、どいつも偉そうなゴタクだけ並べやがって答えらんねえのか糞ども。
230:>>228
02/04/02 23:57
質問に答えてほしいの？煽られるのを待ってるの？
231:sage
02/04/03 02:06
リン酸化は起きますが、酵母には内在性のtyrosine kinaseが無いので、
チロシンリン酸化を起こしてやるためにはtyrosine kinaseを発現させて
やる必要があります。外から入れたtyrosine kinaseが働かないということは
ありません。yeast two-hybrid systemでチロシンリン酸化依存性の（例えばSH2とか）タンパク質の
結合を解析するためにkinaseを入れてscreeningしてる人もいますよ。
232:DAMEMOTO
02/04/03 18:26
>209
ストラタのキットで
pGT(non transformant)とpTRG_GAL11を混ぜたやつだけでコロニーがいっぱいでてきたよ！どうするよ！
あと自分のやつだと大きいやつと小さいやつがでてきたがどうするよ！
233:＞
02/04/03 22:51
そうそう、東大出身は自分がすごく頭が
いいと思いこんでいるから、うまくいかなくて
どつぼにはまっても絶対にあきらめない。
５年たっても７年たっても同じことをやりつづけるよ。
自分のプライドのために。そして院生、ポスドクの
屍骸の山があとにのこされるのであった。ああーめん。
234:名無しゲノムのクローンさん
02/04/05 00:39
＞２３１
では、セリン・スレオニンによるリン酸化は起こるのですか？
235:名無しゲノムのクローンさん
02/04/05 00:51
>>228
tri-hybridなら可能でショ。
細胞工学か実験医学に乗っていたよ
236:名無しゲノムのクローンさん
02/04/08 22:31
>>234
ものによりけりでしょ。酵母に保存されているキナーゼなら可能性アリ。
で、結局ストラタのバクテリオなんたらはどうなの？
237:名無しゲノムのクローンさん
02/05/24 00:01
せっかくもとのライブラリーは10+6オーダーなのに，酵母に入れるとなかなかそこまでは入りません．
何回かくり返せばいいのでしょうが，効率が悪い．
で，質問．
Pretransformed Library買って，matingさせる方法って，簡単に効率良く行くものでしょうか？
やってみるとやっぱりいろいろ問題があって苦労するとかはないでしょうか．情報お知らせください．
クロンテック，値上げしてますます高くなって，手を出すのをためらってます．
あと，たとえば自分で，まずLibraryをtransformさせたのをストックしておいて，
効率が悪くても何回かのtransform分をためておいて，
毎回matingさせてスクリーニングしたりもできるものでしょうか？
baitを何種類かでスクリーニングしてみたい時にはそのほうが楽に思えますが，
どうなんでしょうか？
経験ある方，お教えください．
238:名無しゲノムのクローンさん
02/05/24 00:05
age
239:名無しゲノムのクローンさん
02/05/25 20:35
＞２３７
そのまえに、トランスフォーム効率が悪い原因を明らかにしたほうがいいんじゃないの？
240:名無しゲノムのクローンさん
02/05/26 00:51
１はまだ日記つけてんの?
今日も免沈 明日も泳動 歩きながらもディスカッション
241:名無しゲノムのクローンさん
02/05/26 16:54
GAL4とLexAってどっちがいいんですか？
今は無きLexAの法が擬陽性少ないって聞いたんですけども
本当ですか？
242:１６５
02/05/27 00:20
ssDNAをヒートショックするときにlibraryも一緒にヒートショック→急冷したらどうなりますか？
243:名無しゲノムのクローンさん
02/05/28 01:01
ssDNAやlibraryをどやってヒートショックすんの？age
244:名無しゲノムのクローンさん
02/06/24 23:10
あげ
245:名無しゲノムのクローンさん
02/06/26 21:04
たいへんなんだなぁ～。
246:名無しゲノムのクローンさん
02/07/02 08:47
変な質問なんですが、
２つのタンパク質が（直接）相互作用しないことを言うためには
どうすればいいのでしょうか？
247:名無しゲノムのクローンさん
02/07/02 11:51
>246
無理
248:名無しゲノムのクローンさん
02/07/04 03:14
>>240
立てば免沈 座れば泳動 歩きながらもディスカッション では？
>>241
菌株によるような気もしますがねぇ。
確かに最近LexA使ってないなー
249:名無しゲノムのクローンさん
02/07/04 21:54
Bactero Matchわたしもだめでしたー。
１次スクリーニングで何百かにしぼって
２次スクリーニングで全滅っす。
あれで成功するひといたらまじ聞いてみたい。
250:名無しゲノムのクローンさん
02/07/05 13:21
carrier DNAは既製品が高価なのでherring testis DNAをソニケーションしたいと思っていますが、どなたかソニケーションの至適条件は御存知ありませんか？オーバーソニケーションはキャリア能が著しく損なわれると知人に聞きました。
251:名無しゲノムのクローンさん
02/07/06 12:29
ソニケーションは全くしない方が効率が良い。10mg/mlだと粘くてハンドリング
が大変なので2mg/ml。
252:嘘つきは泥棒の始まり
02/07/06 21:22
two hybridで釣ってきても面沈で引っかからなければ、だめだと思うのですが、それでも論文にするやつは？
253:名無しゲノムのクローンさん
02/07/06 22:52
逝って良し
254:名無しゲノムのクローンさん
02/07/07 09:50
>>252
あのさ、あんたkineticsって分かってる？
255:名無しゲノムのクローンさん
02/07/07 11:16
使わないでおくと停止するけど、腕につけた途端正しい時間を指すようになる時計だろ?
256:名無しゲノムのクローンさん
02/07/07 11:40
わらた
257:?\?q
02/07/09 20:00
はらわた
258:名無しゲノムのクローンさん
02/07/09 21:29
はわらた
259:名無しゲノムのクローンさん
02/07/09 22:29
というわけで、252は物理・数学に弱いＭＤであることが判明。
博士（農学）カモ…
260:名無しゲノムのクローンさん
02/07/10 08:32
>254,259はkineticsで万人に説明できるようになってからえらそうにしなさい。
261:名無しゲノムのクローンさん
02/07/10 08:43
>252,259
どうせ間違いだらけだろうけど、説明してくれよ。
262:名無しゲノムのクローンさん
02/07/10 09:05
>>260,>>261
おいおい、煽るのはともかく、オマエらも分からんのか。
263:名無しゲノムのクローンさん
02/07/10 09:14
>>262
説明して！
264:名無しゲノムのクローンさん
02/07/10 09:22
結合はON rateとOFF rateのバランスで決まるんで、いずれの値も大きい
場合には、vivoでは結合していても、washの過程でコンポーネントの濃度
が事実上ゼロになるＩＰでは解離しちゃうってこと。
265:名無しゲノムのクローンさん
02/07/17 22:32
で、こんな説明で納得したんかよ？>>252, >>260, >>261, >>263
266:名無しゲノムのクローンさん
02/07/17 22:34
Good!
267:名無しゲノムのクローンさん
02/07/18 00:25
>264
vitroに持ってくる前にホルムアルデヒドで結んじゃえば？
268:名無しゲノムのクローンさん
02/07/18 20:02
>>246
～しない。これを示すのは極めて困難。もっと具体的な情報を書いてみたら？
269:なんちゃって博士
02/07/20 23:44
＞＞２５２
Two-hybridで酵素を引っ掛けたものの、IPでどうしても落ちず、止むを得
ずpull-downとBIAcoreでkinetics出してデータまとめて論文にして投稿し
たよ。後の実験で、baitタンパク質がその酵素の活性に影響を与えること
がわかり、vivoでもそれが証明できた。だから別にIPで落ちなくても諦め
る事はないと思うよ。IPだって塩濃度とかいじるけど、よく言えば最適条
件の検討、悪く言えば落としに行っているだけだから。
270:名無しゲノムのクローンさん
02/07/26 03:19
>>264
なっとく。
IPって結局意味無いのね。って極論か。
でも、生物屋やMDはkineticsを全くわかってない奴がほとんど。
そういうやつらがReviewerをやっているんだからまったく鬱だ。
271:名無しゲノムのクローンさん
02/07/26 03:21
kineticsを勉強するのにいい本ってありますか？
272:名無しゲノムのクローンさん
02/07/26 03:40
>>269
それでも綺麗なIPデータがあるほうが良いデータである、というのは間違いのない事実だね。
他にファンクショナルなデータでもあれば別だが。
273:名無しゲノムのクローンさん
02/07/26 04:11
>>272
おまえもkinetics全くわかってねーな。
物理と数学勉強してから大学入り直せ。
274:名無しゲノムのクローンさん
02/07/26 04:46
>>273
すまんな、俺は既にＣＮＳ持ってるんだ。
お前みたいなデータがでないのを理屈こねて言い訳していると話が先に
すすまんのだよ。せいぜいＪＢＣでもだして喜んでいるんだな（藁
275:名無しゲノムのクローンさん
02/07/26 07:34
>>274
うわ、いやなやつ。
どうせじぶんでとったCNSじゃないんだろ。
あたまわるそうだし。
276:名無しゲノムのクローンさん
02/07/26 12:39
架橋剤つかってもIPでだせなかったら、
やっぱりジャーナルの質は２ランク落ちるでしょ。
つうか２ハイブリッて関係ないもん取れ過ぎでは？
277:名無しゲノムのクローンさん
02/07/26 14:33
>>274
生物系の研究だとバカでもCNSに論文が載せられる証左だな。
従来型分子生物学しかできない人々はこれから淘汰されることになるだろう。
278:ATGC
02/07/26 14:48
この期に及んで、とお思いでしょうが、実験に使用している菌株名と入手先を教えていただきたいのですが。
279:なんちゃって博士
02/07/26 15:28
>>272
ま、そりゃそうだね。でもIP出ないからって諦めることは無いと言うことが
言いたかったのよ。IP以外の方法でも結合確認できたら、望みは十分あるよ。
>>278
俺は酵母はAH109株を使っているよ。入手先はクロンテックです。
280:ギャルギャル集合
02/07/26 15:32
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281:名無しゲノムのクローンさん
02/07/28 12:59
two-hybridだけでペーパーになってることありますか？
その時には他にどんなデータが必要なのかな？
282:名無しゲノムのクローンさん
02/07/28 18:50
>>272
「ほうが良いデータ」って、何に比べて良いんだよ？自分の見ている相互作用
がIPできないはずのものだったら、どうしようも無いだろ。それともIPできる
相互作用の方が大事な相互作用だとでも言うのか？それとも良い雑誌に出すた
めなら落ちないものでも落としてみせるってか？
283:名無しゲノムのクローンさん
02/07/28 23:32
＞落ちないものでも落としてみせるってか？
架橋剤を
使うのは有りでしょう。
細胞内で相互作用がなかったら、
two hybridもkineticsもクソもないゴミですから、
intercationを確認する作業は大事です。
それとも生理的意義は重要ではない、
生化学的データがほしい、というの？
284:名無しゲノムのクローンさん
02/07/29 00:03
どうやらツーハイやったのに免沈で落とせなかったために有名誌にリジェ
クトされたことがトラウマになっている奴が一人このスレッドに
紛れ込んでいるようだな。
う ざ い ぞ 。
285:名無しゲノムのクローンさん
02/07/29 00:14
＞２８４
そりゃ自分だろ。
ツーハイやったのに細胞内ではまるで結合しないらしいものひいちゃったのか？
286:名無しゲノムのクローンさん
02/07/29 03:15
いまうちのラボでもツーハイで釣れたものにボスが熱狂してますが、どーしたらいーでしょうか？
287:名無しゲノムのクローンさん
02/07/29 03:32
>285
kineticsにくわしいのに、免沈できなくて論文リジェクトされたのは
あなたですか？
288:名無しゲノムのクローンさん
02/07/29 07:07
当たりは数十個に１個と伝えてくれ。
289:なんちゃって博士
02/07/29 14:33
>>281
出来ることは出来ますが、まともなjournalにはacceptしてもらえないと思った
方が良いです。BBBやJBですらも無理でしょう。国外の雑誌で見掛けた事はあり
ますが、その時は取れてきたタンパク質をぶつぶつに切って、baitタンパク質
との結合領域を決めてましたね。もちろんtwo-hybridで。何にしても信用は
してもらえません。
>>286
IPで落ちるかどうか試してみましょう。出なければpull-downで。とにかくtwo-
hybrid以外の方法で結合を確認することが重要です。
290:名無しゲノムのクローンさん
02/07/29 14:41
プラズモンセンサーをしる！＞286
291:名無しゲノムのクローンさん
02/07/29 14:57
FRETで相互作用をかいせきできんの？
292:なんちゃって博士
02/07/29 18:19
>>291
まあやって出来ないことは無いだろうけど、両方の蛋白が蛍光を発するもので、
FRETが起こるような位置関係に無ければならないので非常に難しいかと思われ。
例え二つのタンパク質が相互作用していてもFRETが起こるとは限らないからね。
293:なんちゃって博士
02/08/08 23:12
保守あげ
294:名無しゲノムのクローンさん
02/08/09 03:21
アタリが数十個に一個って、ホントはくっついてないのにくっついちゃったように見えるのがあるってこと？
それとも、この実験系ではくっつくが実際に細胞の中では起きてない相互作用ってこと？
295:なんちゃって博士
02/08/09 14:07
>294
後者が正解ですな。two-hybridでは確認できても、それ以外の実験系では
確認できないものがゴマンとあります。いろいろな実験系で試しても、相互
作用が確認できるものをアタリとしています。
296:名無しゲノムのクローンさん
02/08/13 21:33
>>294,295
two-hybridの原理をちゃんと把握しましょう。
ベイトやプレイが何かによってはどっちもあり得ます。
297:名無しゲノムのクローンさん
02/08/15 03:38
教えて君してもいい？>>296
298:nana
02/08/15 04:10
やだ、まだこのスレあったの？！ 驚
299:名無しゲノムのクローンさん
02/08/17 03:34
ありましたが、何か！？
>>296
教えてくれ～
300:ミ,,ﾟДﾟノ,っ━~
02/08/17 03:50
>>299
おっと放置プレーｽﾏｿ。すっかり忘れてた。
もし仮にﾍﾞｲﾄとして転写を活性化するような因子、もしくは転写を活性化するような因子とyeastの細胞内で結合しうる蛋白を用いた場合どうだろうか？
ﾍﾞｲﾄがﾌﾟﾚｲと相互作用していなくともyeast細胞内でｾﾚｸｼｮﾝﾏｰｶｰが発現するだろう。
どんなスｽｸﾘｰﾆﾝｸﾞ方法を使っているのかはよく分からないが単純にgrowth
が+ or -だけで判定しているとそういうﾊﾞｯｸｸﾞﾗｳﾝﾄﾞが出る可能性もある。
また何か解らなかったらｶｷｺしてくれ。放置ﾌﾟﾚｰのお詫びに解る範囲でお答え
するよ。
301:名無しゲノムのクローンさん
02/08/17 13:25
それは、単純にベイト依存性をチェックして落とせるんじゃないの？
302:名無しゲノムのクローンさん
02/08/17 14:08
>>300, 301
議論ｷﾎﾞﾝ
303:ミ,,ﾟДﾟノ,っ━~
02/08/17 16:10
うーん。ﾍﾞｲﾄの依存性がﾁｪｯｸできるのかな？まずどんな条件でｽｸﾘｰﾆﾝｸﾞを
行ったのかがｲﾏｲﾁよく解らないのでﾁｮﾄ議論しようがない。
まあ>>294は最低限、生えてきたyeastからplasmidを回収してﾌﾟﾚｲが存在
すること&ﾍﾞｲﾄとﾌﾟﾚｲを入れ替えてもyeastはhappyに生きられることを確認
するべきだろうな。
今からﾁｮﾄ落ちます。また今夜出没予定です。
304:名無しゲノムのクローンさん
02/08/17 19:49
なるほろ～
勉強になります。
305:名無しゲノムのクローンさん
02/08/18 11:55
baitとpreyの入れ替えなんて自己満足以上の意味あんのか？bait特異性が確認できたら、two-hybridの仕事はそこで終わり（結合領域を決めるとかはともかく）。すぐに本来のシステムで検証でしょ。two-hybridなんて所詮first screeningの手段なんだから。
306:ミ,,ﾟДﾟノ,っ━~
02/08/18 12:15
>>305
>baitとpreyの入れ替えなんて自己満足以上の意味あんのか？bait特異性が確認...
baitとpreyが何かﾜｶﾗﾝから答えようがないな。bait特異性をどうやってするんだね？
使っているbaitが酵母内で何かと相互作用している可能性を排除できるのかね？
まあbaitとpreyを入れ替えるのが自己満足以上の意味があるのかという質問には「ある」
と答えさせてもらおうか。データはたくさんあればあるほど信頼性は増すのでね。
>two-hybridの仕事はそこで終わり（結合領域を決めるとかはともかく）。
同意だな。two-hybridなんざで蛋白同士が結合するなんて主張しても弱すぎて相手にされん。
特に機能未知の因子なんかではね。IPするなり、合成効果を見るなり、共局在を見るなりしない
と論文にするには苦しいな。
307:ミ,,ﾟДﾟノ,っ━~
02/08/18 12:17
ｵﾄ、>>306
bait特異性をどうやって確認するんだね？←訂正
308:名無しゲノムのクローンさん
02/08/18 17:39
age
309:名無しゲノムのクローンさん
02/08/19 22:50
>>306
bait特異性ってのは、そのpreyが問題にしているbaitに対してはpositiveで、コントロールのbait（キットに入ってるから皆ラミンを使ってるね）に対してはnegativeってことで十分だろ。
baitとpreyを入れ替えてnegativeになったらやめんのかよ。two-hybridが擬陰性になる理由なんて５億６千７百万あるぜ（藁
310:ミ,,ﾟДﾟノ,っ━~
02/08/20 03:24
>>309
>bait特異性ってのは、そのpreyが問題にしているbaitに対してはpositiveで、
コントロールのbait（キットに入ってるから皆ラミンを使ってるね）に対しては
negativeってことで十分だろ。
baitとpreyを入れ替えてnegativeになったらやめんのかよ。two-hybridが擬陰
性になる理由なんて５億６千７百万あるぜ（藁
↑
何を言いたいのかよくﾜｶﾗﾝがコントロールのbaitで擬陽性になったらどうするんだね？
two-hybridが擬陽性になる理由なんて５億６千７百万あるぜ（藁。擬陽性になったら
見なかった事にでもするのかね？
まあ、あんまし揚げ足とってもしょうがないがbaitとpreyを入れ替えてnegativeだっ
たらcandidateから外すというのも絞り込む方法の１つだな。多分複数個あるんだろ？
こういう手法を使う人はそんなに珍しくないぞ。論文読んでるかな？plasmidから切り
出してvectorを変えるくらいすぐにできるし大した手間じゃないだろう？
研究を進める上で最も重要なのはここは100%確かであるという土台をキッチリと作る
ことだ。two-hybridでもIPでも共局在でもなんでもいいからとにかくこのデータは100%
信頼できるという土台を作りたまえ。焦って前に進むことばかり考えてると経験上ろくな事
はないな。俺としてはtwo-hybridなんかは片手間でできる仕事なんだから同時進行で次の
実験を進める事をお奨めする。
そもそも>>294のquestionはbaitとpreyが結合していなくともyeastが生えてくる事があるの
かってことだろう？Answerとしてbaitやpreyの性質によってはあり得る。しかしなにを使っ
たのかﾜｶﾗﾝから答えようがないで何か問題でもあるのか？
311:名無しゲノムのクローンさん
02/08/21 01:13
>>310そもそも>>294のquestionはbaitとpreyが結合していなくともyeastが生えてくる事があるの
>かってことだろう？Answerとしてbaitやpreyの性質によってはあり得る。しかしなにを使っ
>たのかﾜｶﾗﾝから答えようがないで何か問題でもあるのか？
結合しなくても激しく生えてきますが。。。。ばか？
312:ミ,,ﾟДﾟノ,っ━~
02/08/21 01:25
>>311
ん、何が言いたいんだね？夏厨か？yeast two-hybrid法って知ってるのか？
それとも日本語が理解できないのか？ﾏｱ、ｵﾚﾆﾊﾄﾞｯﾁﾃﾞﾓｲｲｶﾞﾅ。
元々の質問者もいないようなのでそろそろ落ちるかな...
313:名無しゲノムのクローンさん
02/09/02 23:04
>310
ああ、こういう知ったかぶりして、その実なんも分かってないヤツっているよな。
> コントロールのbaitで擬陽性になったらどうするんだね？
> two-hybridが擬陽性になる理由なんて５億６千７百万あるぜ（藁。
> 擬陽性になったら見なかった事にでもするのかね？
これで、baitとpreyを入れ替えて結果がpositiveでもnegativeでもやるこた
変わらねえだろってのに対する反論になってると思ってんのかね。
controlのbaitで擬陽性になることだってあるだろうが、それはtwo-hybrid
のレベルじゃ答えがでるこっちゃねえんだよ。two-hybridの結果からはpositiveとは言えない以上、よっぽどsexyな分子でもない限りそこで捨てる
だろ。それでも執着するなら、それは本人の思い入れで理性のレベルの話じ
ゃない。偉そうな能書き垂れてねえで少しは頭使えや。
314:女性専用女性の方訪れてください
02/09/02 23:05
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楽しんでください。
315:age
02/09/25 21:27
保守あげ
316:age
02/09/27 23:07
あげあげ
317:名無しゲノムのクローンさん
02/09/27 23:41
何げに良いスレだね
318:名無しゲノムのクローンさん
02/09/27 23:44
何を言う！！
生物板で僅少の良スレなり。
319:age
02/09/28 00:17
最近はtwo-hybridも皆順調なのかな。
320:名無しゲノムのクローンさん
02/09/28 01:34
近々始める予定なのでご指導ご鞭撻よろしくお願いします。
321:age
02/09/28 01:39
おう、何でも聞いてくれい。
322:名無しゲノムのクローンさん
02/09/28 12:02
ありがと～
323:名無しゲノムのクローンさん
02/09/28 14:09
ｳﾌ
324:名無しゲノムのクローンさん
02/09/28 18:22
GAL4とLexAどっちがいいの金？
325:あげ
02/09/28 22:07
一般論ですが、LexAのシステムのほうが感度が良く、酵母のものではないたんぱく質を用いているため、ノンスペも少ないと言われています。だからレックスの方がベターかなと言う気がします。
326:名無しゲノムのクローンさん
02/09/29 00:58
じゃあGAL4のメリットないじゃん
327:あげ
02/09/29 02:08
システムのセットの値段がLexより安い事かな。あとは、ベクターの種類が豊富なので、ベイトたんぱく質の発現量を選択出来ることかな。毒性有るたんぱく質を高発現ベクターに入れて酵母に突っ込むと、生えてこないことがある。
328:名無しゲノムのクローンさん
02/09/29 04:22
なるほど。
ありがとございます。
329:名無しゲノムのクローンさん
02/09/29 20:08
安かろう悪かろうってこと？
330:名無しゲノムのクローンさん
02/09/30 09:49
同じbait & preyの組み合わせで比べても、LexAの方が感度が良いってことは
無いよ。酵母のタンパク質じゃないからノンスペが少ないってのも、後発の
LexAの開発者の宣伝文句で証拠がある話じゃない。うちのラボでいろんなbait
についてこれまでやってみた結果だと、強い相互作用のものはどっちでも取れ
てくる。弱めのものはどちらか一方でしか取れないこともあるが、GAL4でしか
ポジにならないのとLexAでしかポジにならないのが同じぐらいある。どっちも
試すだけのマンパワーがあるならそうした方が良いだろうし、どっちか一方だ
けなら、既に近所のラボで使ってていろいろ相談できる方にするのが良かろ
う。
331:名無しゲノムのクローンさん
02/10/01 00:28
ためになるなぁ～げ
332:age
02/10/01 13:11
age
333:age
02/10/02 21:44
age
334:age
02/10/06 23:47
age
335:名無しゲノムのクローンさん
02/10/09 03:56
最近質問鎮静化か?
336:名無しゲノムのクローンさん
02/10/09 21:06
Two-hybridって立ち上げてお蔵入りになるのってどのくらいの割合？
337:名無しゲノムのクローンさん
02/10/09 21:10
９９％保証するよ
338:名無しゲノムのクローンさん
02/10/09 23:23
うちではscreeningしてみたうち論文にこぎつけたのが３割かな。
339:名無しゲノムのクローンさん
02/10/10 02:30
なかなか厳しいねぇ
340:名無しゲノムのクローンさん
02/10/10 10:32
それより1はどうした？
341:名無しゲノムのクローンさん
02/10/10 13:15
氏にますた
342:名無しゲノムのクローンさん
02/10/11 00:06
ソースきぼんぬ
343:1
02/10/11 23:45
今は研究を辞めて、というか大学を辞めてフリーターしてます。
344:名無しゲノムのクローンさん
02/10/12 11:56
そうか・・・
345:名無しゲノムのクローンさん
02/10/12 16:35
two hybridで採れたほとんどがartifactじゃないの？
346:名無しゲノムのクローンさん
02/10/12 19:34
論文読んでるか、おまえ。
347:名無しゲノムのクローンさん
02/10/12 20:55
345はリア高なので許して下さい＞３４６
348:名無しゲノムのクローンさん
02/10/14 12:01
今もツーハイでスクリーニングなんてやってるわけ？
349:名無しゲノムのクローンさん
02/10/15 09:45
論文読んでるか。
350:名無しゲノムのクローンさん
02/10/15 19:07
卒業までやることなくなってきたからツーハイでもやろっかな。
ほかにやることねえしなあ
351:名無しゲノムのクローンさん
02/10/16 02:30
タンパク質同士が結合するのって何結合が多いの？
352:名無しゲノムのクローンさん
02/10/18 23:22
みんな知らないの？
353:名無しゲノムのクローンさん
02/10/19 00:37
ダイサルファイドゥボンドもしくはハイドロジェンボンド
354:名無しゲノムのクローンさん
02/10/19 01:00
だとしたらどうしてtwo-hybridで検出できるの？
355:名無しゲノムのクローンさん
02/10/19 03:30
俺も知りたい
356:名無しゲノムのクローンさん
02/10/19 12:11
漏 れ も ！
357:名無しゲノムのクローンさん
02/10/19 12:27
細胞内だから疎水結合＋イオン結合だろ
358:名無しゲノムのクローンさん
02/10/19 22:59
だよな・・・つか弱くない？＞疎水＋イオン結合
359:名無しゲノムのクローンさん
02/10/20 03:19
>>354
ツーハイブリッドの仕組み把握してるか？
360:名無しゲノムのクローンさん
02/10/20 18:35
>>359
核内で結合を見る＝ダイサルファイドゥボンドができない環境＝タンパク質間結合にはダイサルファイドゥボンドが多い＝two-hybridで検出＝なぜ？っていう流れですが何か？
361:名無しゲノムのクローンさん
02/10/20 19:40
>>360
ネタだよね？
362:名無しゲノムのクローンさん
02/10/20 20:55
360痛いから素無視の方向で。
363:名無しゲノムのクローンさん
02/10/21 01:02
痛いのはここまでのレスだよ。
364:名無しゲノムのクローンさん
02/10/22 00:02
ageときます
365:名無しゲノムのクローンさん
02/10/23 22:46
α相補性ってどうよ？
366:名無しゲノムのクローンさん
02/10/23 22:47
確認ならともかく、スクリーニングには使えないでしょ。
367:名無しゲノムのクローンさん
02/10/23 22:49
SOSにベイトを繋いでミリスチル化基ライブラリーによりRas経路を活性化させる「サイトトラップ」って、どうよ？
368:名無しゲノムのクローンさん
02/10/23 22:51
cdc25のsuppressorによるバックグラウンドが高すぎる。これも一対一の確認ならともかく、スクリーニングはかなり辛いものになると思われ。
369:名無しゲノムのクローンさん
02/10/23 22:59
cdc25＞cdc2の脱リン酸化酵素？それともrasのGTP交換因子？
ras経路をバイパスするマルチコピー差プレッサーってそんなに沢山あるの？
370:名無しゲノムのクローンさん
02/10/23 23:07
367にもRas経路って書いてあるだろ！
マルチコピーサプレッサーじゃなくて、ホストの酵母がRas-cAMP経路を活性化するような変異を噛むってこと。
371:名無しゲノムのクローンさん
02/10/23 23:14
マルチコピーサプレッサーとして、Ａキナーゼが取れて来る…ね、Ａ山先生！
372:名無しゲノムのクローンさん
02/10/25 17:53
>367
どこのメーカーからでてる？
373:sage
02/10/25 20:25
>372
Stratagene
374:灯台院生 ◆ipJni/6Rlw
02/10/25 22:43
サイトトラプ話は禿しくガイシュツですね・・・
375:372
02/10/25 23:04
>>373
あんがと。勉強してみます。
376:名無しゲノムのクローンさん
02/10/26 21:20
おまいらcytotrapについて語ってるが実際にやったのか？
377:名無しゲノムのクローンさん
02/10/26 21:25
GATEWAYのシステム使ってる奴いる？
どうよ？
378:落伍者
02/10/26 22:29
ライブラリー自作に失敗したので、萎えますた＞サイトトラップ
N末に短いミリスチル化基付加コンセンサスサイトが付くだけなのになんであんなにでかいプラスミドなんだ？＞pMyr
379:＞378
02/10/27 15:39
へたくそ！
380:名無しゲノムのクローンさん
02/10/27 23:52
>>379
未経験者が！ペッ！！
381:名無しゲノムのクローンさん
02/11/02 01:37
本物の相互作用って何個スクリーニングするとあるの？
何パーセントくらいなの？軽く一桁かな？
382:名無しゲノムのクローンさん
02/11/02 03:40
何万もスクリーニングするから１パーもない
383:名無しゲノムのクローンさん
02/11/02 11:09
>>378
で、やめたの？
384:名無しゲノムのクローンさん
02/11/02 13:08
1は何かいいの釣れたの？
385:名無しゲノムのクローンさん
02/11/02 13:27
>>384
お前らが釣れた
386:名無しゲノムのクローンさん
02/11/03 11:46
>>385
お前が一番釣らr(以下略
387:名無しゲノムのクローンさん
02/11/08 19:04
age
388:名無しゲノムのクローンさん
02/11/12 21:57
既出ながらケリの付いていないBacteriomatchは結局のところ使い物になんの？市販されるようになってから何年か経つのに、論文じゃ見かけないけど。
389:age
02/11/12 23:52
だめなんじゃん
390:名無しゲノムのクローンさん
02/11/20 07:56
保全age
391:名無しゲノムのクローンさん
02/11/22 16:46
1でてこい
392:名無しゲノムのクローンさん
02/12/02 18:13
.
393:名無しゲノムのクローンさん
02/12/22 02:37
コロニーたくさん出てきました。
ベイトとくっつくもの沢山あるってことすか？
394:名無しゲノムのクローンさん
02/12/22 13:31
それはこれからお前が明らかにする
395:名無しゲノムのクローンさん
02/12/22 20:01
どうしても一方向のIPしかとれないとき、相互作用の確信を持てますか？
396:名無しゲノムのクローンさん
02/12/22 20:53
落ちないほうの抗体がまずい（多量体中にあって露出しているかとか）
397:名無しゲノムのクローンさん
02/12/27 01:43
それってスレ違い
398:名無しゲノムのクローンさん
02/12/27 07:26
１が来ますように
399:名無しゲノムのクローンさん
02/12/28 21:28
片手間らしいから
400:名無しゲノムのクローンさん
02/12/29 01:29
400~~
401:名無しゲノムのクローンさん
02/12/29 01:35
やめちゃったんじゃない？？
402:名無しゲノムのクローンさん
02/12/29 03:01
じゃあ今日からここはボクの日記にします。
403:名無しゲノムのクローンさん
02/12/29 03:01
じゃあ早速書いてくれ>>402
404:新ボクの日記1
02/12/29 12:57
年末にベクターを注文した。
年明け早々にも持って来てくれると業者が言った。
405:名無しゲノムのクローンさん
02/12/29 13:01
選んだのはBacterioMatchか？
406:名無しゲノムのクローンさん
02/12/29 13:27
ライブラリはどうしましたか？
407:新ボクの日記2
02/12/30 19:11
ボスがアメリカの何とかって人からもらうと言ってました＞ライブラリ
408:新ボクの日記3
02/12/30 22:50
＞＞４０５
違います
409:名無しゲノムのクローンさん
02/12/31 17:33
大晦日age
410:名無しゲノムのクローンさん
03/01/04 01:07
正月age
411:名無しゲノムのクローンさん
03/01/04 05:05
新ボクは週明けから実験再開？
412:名無しゲノムのクローンさん
03/01/05 02:49
>>411
ベクター来るまで休みじゃね？
413:新ボクの日記4
03/01/05 21:47
明日から頑張ります！
ご指導よろしくお願いします！
414:名無しゲノムのクローンさん
03/01/05 21:50
がんばれや。正月はちゃんと休んだか？
415:新ボクの日記5
03/01/05 21:52
＞＞４１４
ありがとございます！
しっかり実家で休んできました！！
416:名無しゲノムのクローンさん
03/01/07 01:36
初日の成果を期待あげ
417:名無しゲノムのクローンさん
03/01/07 02:08
まだ何も届いてないだろ
418:新ボクの日記６
03/01/08 00:06
＞＞４１７
そうです。
まだ何も来てないので別の実験してます。
419:新ボクの日記7
03/01/11 01:13
ベクターとプライマーが届いたのでPCRして
制限酵素で切ってライゲーション。
特に今のところ問題ないです。
420:名無しゲノムのクローンさん
03/01/11 01:32
システムくらい教えろ
421:名無しゲノムのクローンさん
03/01/11 03:05
ﾏﾀｰﾘﾏﾀｰﾘ
422:山崎渉
03/01/11 13:20
（＾＾）
423:名無しゲノムのクローンさん
03/01/12 00:07
>>421
おそらくGALだと思うけど。
424:423
03/01/12 00:08
>>421×
>>420○
425:名無しゲノムのクローンさん
03/01/14 12:07
保全あげ
426:名無しゲノムのクローンさん
03/01/14 13:12
結局、two-hyで取れてもなんの手がかりにもなってない気が・・・
免沈でやっとくっつきますっていえるんだよね。だったら最初から免沈やれよ的な
実験方法だよね。
427:３３０３
03/01/14 13:18
指が２０本の訳をおしえて？
428:名無しゲノムのクローンさん
03/01/14 13:42
you have twenty digits in total
429:名無しゲノムのクローンさん
03/01/14 21:37
>>426
免沈でどーやってスクリーニングするつもりだ？あ？
430:名無しゲノムのクローンさん
03/01/14 21:51
プロテインチップ使えやドアホ
431:名無しゲノムのクローンさん
03/01/14 21:57
プロテインチップが免沈か？というツッコミはともかく、そんなもん、two-hybridよりよっぽどいい加減だろ。おまけにたかだか数百のタンパク相手にスクリーニングかよ。
432:名無しゲノムのクローンさん
03/01/15 00:02
すごい良いスレになるかと思ったけど、
やっぱ日記系は大変なんだな。
途中でみんな逃げちゃう。
まあ良い発想だったよ>>1は
433:名無しゲノムのクローンさん
03/01/15 00:07
いまごろ>>1は何やってるのだろうか、、、、
434:名無しゲノムのクローンさん
03/01/15 00:11
>429
最近では免沈で落ちてきたバンドを質量分析使って片っ端から読む
奴が増えてきているから426はバカにするほどとんでもないこと言って
るわけではない。
結局とれてきたものと何か機能的に関係あるかどうか解析しないと
いい論文にならない。というか、そうでないと信用できない。
435:新ボクの日記8
03/01/15 00:16
ひとまずsequenceをしてin frameであることを確認。
まだまだペーペーの僕でもここまでは何とかできた。ホッ。
436:名無しゲノムのクローンさん
03/01/15 00:21
あ、戻ってきた。
ところで30℃のインキュベーター確保するのも結構大変じゃないか？
437:426
03/01/15 13:27
>>434
ｻﾝｸｽｺ。折れも3年間ツーハイやってたんだよね。で、駄目だったわけで、その経験
からこういう発言をしたわけ。助手が考えたテーマだったんだけど、教授にこう言
われて反対された。いやな香具師だったけど、助手じゃなく教授を信じればよかった
と今も思う。ま、結果論だけどね。
438:名無しゲノムのクローンさん
03/01/16 01:07
まだかなまだかな～新ボクの日記はまだかな～
439:新ボクの日記9
03/01/18 01:19
ライブラリーが届きました。
>>436
30℃専用のがあるので大丈夫です。
440:山崎渉
03/01/18 12:55
（＾＾）
441:名無しゲノムのクローンさん
03/01/19 19:32
成功祈願
442:名無しゲノムのクローンさん
03/01/24 02:27
なにかと並行してやってるサブテーマなんだろか。
443:名無しゲノムのクローンさん
03/01/24 17:56
30度だったらその辺の暖かい部屋に置いておけば育つんじゃない？
444:名無しゲノムのクローンさん
03/01/24 18:34
あのねえ、タンパク質のインタラクション調べてんだろ？
温度だって重要なファクターなんだからてきとうじゃだめだろ
445:名無しゲノムのクローンさん
03/01/24 19:12
>>444
温度ってそれほど重要なファクターになるの？
無知なので教えてください。
446:名無しゲノムのクローンさん
03/01/24 23:09
>>445
例えば、22度が適正な生育温度な生物のタンパクでは
30℃では取れてこなかったものが、22℃でイーストを育てると
ちゃんと取れてきたりする。
447:名無しゲノムのクローンさん
03/01/29 22:45
>>446
じゃあ大腸菌で組み換えタンパクを発現させる時は
そのタンパクの由来する生物の至適温度がよいってことか？
448:名無しゲノムのクローンさん
03/01/30 15:19
まあ、なんだ至適温度なんて一概に言えることでもないような気もするが。
449:名無しゲノムのクローンさん
03/01/30 15:19
★URLﾘﾝｸ(www6.ocn.ne.jp)★
★こんなサイト見つけました★
450:名無しゲノムのクローンさん
03/01/31 23:50
>>448
いるいる。
こうやって話の腰を折る香具師（w
451:名無しゲノムのクローンさん
03/02/03 01:51
新ボク用age
452:新ボクの日記10
03/02/07 23:25
コロニーがたくさん生えてきた。
こんなにくっつくタンパクこんなにたくさんあるのかな？
スクリーニング条件もっと厳しくしようかな？？
453:名無しゲノムのクローンさん
03/02/07 23:39
そうやってハマっていくのか。。。
454:名無しゲノムのクローンさん
03/02/08 16:27
そうやってハマって逝きます・・・
455:名無しゲノムのクローンさん
03/02/08 16:40
ああ、いっぱい免珍しないといけないね・・・やることがいっぱいあって
よかった・・・かな？ ここから片手間の実験でなくなってくるんだよな・・・
456:名無しゲノムのクローンさん
03/02/08 21:31
>>455
禿道
457:名無しゲノムのクローンさん
03/02/09 00:53
シーケンス読むことを考えるとあまり数が多いのはお薦めできないな
458:名無しゲノムのクローンさん
03/02/09 00:59
つうかおまえら。
数が多い時点で信ぴょう性が、、、
459:名無しゲノムのクローンさん
03/02/09 01:58
>>458
条件を厳しくした結果を待ちましょうや。
460:名無しゲノムのクローンさん
03/02/09 02:50
>>457
今のシーケンサーを甘くみちょるな。w
461:名無しゲノムのクローンさん
03/02/09 11:49
>>460
どうせ海老愛さまさまなんだろ。ﾌﾟｯ
462:名無しゲノムのクローンさん
03/02/09 12:53
べっく男最強！
463:名無しゲノムのクローンさん
03/02/09 14:19
ﾊｧ？どこが？
464:名無しゲノムのクローンさん
03/02/09 17:26
コロニー多いとプラ抽が大変なんだよね。クローンがかぶって来たら、シークエンス
行く前にPCRで落とすべし。
465:名無しゲノムのクローンさん
03/02/09 22:47
>>464
なにいってんだ？コロニーPCRでふやしてシーケンスだろ
466:名無しゲノムのクローンさん
03/02/10 01:48
１００個くらいシークエンスしろ。アッという間にできるぞ。
467:新ボクの日記11
03/02/20 00:23
とりあえず全て読めとの指令によりシーケンスの鬼と化していました。
転写因子が沢山釣れました・・・
468:名無しゲノムのクローンさん
03/02/20 01:17
面白そうな奴だけにしとけー。
469:名無しゲノムのクローンさん
03/02/20 16:54
経験からいうと、ここからはくっつく奴を探すのではなくて、こじ付けが出来そうな
めぼしいクローンを選んでそれをどうにかくっつける作業になる。
470:bloom
03/02/20 16:59
URLﾘﾝｸ(www.agemasukudasai.com)
471:名無しゲノムのクローンさん
03/02/20 22:54
>>467
疑陽性な悪寒
472:名無しゲノムのクローンさん
03/02/21 09:14
がんがれよ。ところで、こういう風にイーストでたくさん取れた場合、条件を厳しく
するというがそれはどの程度効果的なのだろう？ いくら条件を厳しくするといって
も、イーストの話だよね。その条件を厳しくすることで、真ん丸での陽性率って上が
るのだろうか？
473:名無しゲノムのクローンさん
03/02/21 22:35
>>472
弱い相互作用は偽という前提で厳しくするから金銀財宝を失うこともある。
474:名無しゲノムのクローンさん
03/02/21 23:09
だからこそおいしそうなクローンを「くっつける」わけですわ。
475:名無しゲノムのクローンさん
03/02/25 03:30
厨房とは相互作用できん！
476:名無しゲノムのクローンさん
03/02/26 15:16
イーストでの相互作用の強さとまん丸細胞での免疫沈降での相互作用の強さは比例
するの？ もし比例するならイーストで真っ青のクローンを取ると免珍が出来やす
いってことになると思うけど、でも折れはそうは思えないんだよね。もし経験者が
いたら教えてYo!
477:応援します
03/02/26 15:18
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478:名無しゲノムのクローンさん
03/02/27 00:26
>>476
する。
479:名無しゲノムのクローンさん
03/02/27 09:32
>>478
だったらあるベイトに対して論文で報告された免沈もできるクローンがあるとする。
それをコントロールにしてそれよりも青く染まってるクローンを拾えば、かなりの
確率で免珍まで出来るクローンが取れるということになるんですが・・・本当にそ
うでしょうか・・・それならみんなもっと成功してるはずなんですけど。するって
だけでなくて具体的に教えていただけると幸いです。
480:名無しゲノムのクローンさん
03/02/27 19:25
>476
しない。
481:名無しゲノムのクローンさん
03/02/27 22:01
プロテインキナーゼと基質の相互作用って
Two-hybridで検証できるもん？
K>M変異体とか結合するけどリン酸化しない
不活性型キナーゼにしないとだめ？
482:名無しゲノムのクローンさん
03/02/27 22:09
ユビキチンープロテアソーム系を使った新しいタイプの
Two-hybridシステムについて教えて下さい
483:名無しゲノムのクローンさん
03/02/28 05:06
＞４８２ おれもしりたい
484:名無しゲノムのクローンさん
03/03/05 07:36
オーソドックスのものと比べてどういう利点があるんでしょうか？
また、これからの新しい手法にはどういう利点が求められているんでしょうか？
485:山崎渉
03/03/13 13:42
（＾＾）
486:山崎渉
03/03/13 13:50
（＾＾）
487:名無しゲノムのクローンさん
03/04/05 22:38
新年度あげ
488:名無しゲノムのクローンさん
03/04/08 22:41
>>484
利点
膜タンパク質にも使える。
転写活性化能を持って古典的two-hybridが使えないbaitにも使える。
欠点
経験の蓄積が少なくどこまで汎用性があるか不明。
試料が広く出回っていない。
ご近所に相談できる人がいない。
489:山崎渉
03/04/17 09:05
（＾＾）
490:名無しゲノムのクローンさん
03/04/23 00:58
みんなもうやってないの？
491:名無しゲノムのクローンさん
03/04/23 22:11
やらされてまつ
492:名無しゲノムのクローンさん
03/05/06 06:26
まーツーハイはスクリーニングにはおすすめしないね、俺は。
493:名無しゲノムのクローンさん
03/05/06 23:13
スクリーニングに使わないで何に使うと？
494:名無しゲノムのクローンさん
03/05/07 09:49
結合部位の決定
495:名無しゲノムのクローンさん
03/05/08 02:51
そうだな。俺もこの方法でスクリーニングはやりたくない。
496:名無しゲノムのクローンさん
03/05/16 02:06
学部にはちょうどいいだろう。
497:名無しゲノムのクローンさん
03/05/16 09:46
でもさ、major impact journalにコンスタントに出ている某ラボの論文、読んで
みたらほとんどがtwo-hybridで取った新しい分子の解析だったよ。もちろん取っ
てからの仕事が凄いんだけど。結局、アメリカのビッググラボが予想もしてない
ような分子を取って、こっそりデータを積み重ねるってスタイルにしようと思っ
たら、two-hybird位しかないんじゃない？
498:sage
03/05/16 10:09
>497
そのラボはY2Hに関してのノウハウの蓄積があるからこそできると思われるが、、。私も>494に同意。
499:名無しゲノムのクローンさん
03/05/16 10:18
>497,498
日本にもそういうラボがあるが、Y2Hに関してのノウハウの蓄積という
か、その後のデータをでっちあげるノウハウの蓄積があるんだと思う。
中には変異体の表現型まで一致するきれいな論文もあるが、怪しい
論文が多い。多すぎる。
実際にY2Hのクローニング論文がノックアウトなどで否定されている
のを何度も見たことがある。
500:動画直リン
03/05/16 10:25
URLﾘﾝｸ(homepage.mac.com)
501:名無しゲノムのクローンさん
03/05/16 10:46
Y2Hはむやみとリボゾームタンパク質やHSPがひっかかってくるよな。
502:名無しゲノムのクローンさん
03/05/16 10:51
URLﾘﾝｸ(www.fccc.edu)
false positiveの簡単な一覧です。参考までに。
503:名無しゲノムのクローンさん
03/05/17 19:20
とゆーわけでﾂｰﾊｲはｶﾞﾁﾝｺ向きでｽｸﾘｰﾆﾝｸﾞ向きではないとゆーことでよろしいか？
504:名無しゲノムのクローンさん
03/05/23 00:57
漏れもそう思うから意義無しっす。
505:山崎渉
03/05/28 14:24
∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ ( ＾＾ ） ＜これからも僕を応援して下さいね（＾＾）。
＝〔~∪￣￣〕
＝ ◎―◎ 山崎渉
506:酵母初心者です
03/06/08 00:58
だれかいたら教えてください。
酵母でインサートチェックのコロニーPCRやってるんですけど
同じ一つのコロニーでも、インサートが確認できたり、できなかったりで
結果が安定しません。
滅菌水10ulにコロニーをPickして１００℃で１０分ボイルしてその上清1ulを
サンプルにして、20ulの系でPCRを行っています（酵素はKOD Dashです）。
サンプル調製やサイクルなどでコツなど知っていらっしゃる方がいたら是非
教えて下さい。よろしくお願いします。
507:名無しゲノムのクローンさん
03/06/08 13:13
懐かしいスレが上がってるな。それはともかく、酵母のコロニーPCRはなかなかtrickyで決定版がないように思うが、とりあえずこんなのはどうだ？
URLﾘﾝｸ(www.vbl.yamaguchi-u.ac.jp)
URLﾘﾝｸ(www.users.kudpc.kyoto-u.ac.jp)
URLﾘﾝｸ(food.food.kyoto-u.ac.jp)
508:名無しゲノムのクローンさん
03/06/08 14:07
>>506
そもそもインサートチェックってのはアタリが出れば良し、じゃないの？
KOD dashを使ってる時点でリッチラボとみた。
増幅の長さを短くしては？３００ｂｐぐらいとか。
509:酵母初心者です
03/06/08 22:02
>>507
早速レスありがとうございます。
やっぱりZymolyaseで処理するのが一番確実なのでしょうか？
NaOHを使う方法は知りませんでした、早速明日試してみます。
ありがとうございました。
>>508
>>増幅の長さを短くしては？
というのはどういうことでしょうか？
説明不足だったのかも知れませんが、上に書いた「結果が安定しない」というのは
青コロニーをPickしてレプリカプレートに移して、再度コロニーPCRかけると
最初Pickした時検出できたインサートが検出できなくなったりすることが結構ある
ので何かプロトコールにまずい点があるのかと思ったのですが・・。
プライマーはMCSの両端を挟むプライマーを使っています。
510:名無しゲノムのクローンさん
03/06/09 09:38
コロニーPCRの失敗は多くの場合、菌体の入れすぎが原因と思われ。楊枝も物によっては悪さをするので、チップを使うのが吉。
511:酵母初心者です
03/06/09 23:19
みなさんありがとうございました！！
NaOHでサンプル調製して、菌体の量少なくしたら、うまく行きました。
酵母が多すぎてもだめなんですね。素人なものでなるべく多いほうがいいのかと
思っていました。>>510さんありがとうございました。
もうスクリーニングの段階なので時すでに遅しなんですが、今後の参考のために
もう一つ・・・（ずうずうしくてすいません）。
Maitingさせた酵母をプレートにまく時、どのようにしてまくのがよいので
しょうか？？ というのは、生育してきた酵母がちゃんとコロニーに
ならず、一面に広がってしまったようなプレートがいくつかあって、部分的に
青いところはあってもどこまでが単一コロニーなのかわからないのでPickUP
できないものがありました。
播き方は大腸菌とほとんど同じで150ｍｍのプレートにX-Galを塗って１５分
くらい乾かして、そのあとコーンラージ棒で菌体を200ul塗り広げました。
乾かし方が甘かったのか・・、菌の量が多いのか・・、塗り方が下手なのか・・、
そういうプレートもたまにあるのか・・、知ってる方がいたら教えて下さい。
よろしくお願いします。
512:名無しゲノムのクローンさん
03/06/09 23:52
mating法はClontechのプロトコルだとどうしても菌体量が多くなりがちだ
よね。きれいに均一にまけてれば問題ないだろうけど。コツは十分プレー
トを乾かしておくことと（作ってから２日ほど室温に放置）、5mm径のグ
ラスビーズなどを使って均一にまくことかな。菌が厚くたまったあたりが
うっすら青いのは怪しいので無視。
513:酵母初心者です
03/06/10 00:34
グラスビーズって使ったことないんですけど、どうやって使うんでしょうか？？
あとプレートにはX-Galはあらかじめ混ぜておいたほうがいいってことでしょうか？
すいません、本当に初心者なもので。
514:名無しゲノムのクローンさん
03/06/10 08:46
platingしたい菌の懸濁液と、滅菌しておいたグラスビーズを15cm dishなら
10～20コくらいプレートに載せて（注ぎ？）、プレートを水平に縦縦横横とジャ
ラジャラ振ると均一に塗り広がる。グラスビーズは良く洗って再利用できるよ。
515:名無しゲノムのクローンさん
03/06/10 08:55
あ、X-α-Gal（だよね？）はあらかじめ混ぜておいた方が楽だけど、
platingの直前に塗り広げた場合よりは発色が薄くなると言われているけ
ど、強い相互作用を示すものなら気にしなくて良いんじゃないかな。Ade
Hisで選択をかけて生えてきたものが数百程度なら（パイロット実験を
やっておくっちゅうことね）、最初のスクリーニングのプレートにはX-α
-Galを入れないで、拾い直す次のプレートに多めに入れるという手も。
516:酵母初心者です
03/06/11 00:00
グラスビーズってそうやって使うんですね。
早速今日発注しておきました。
本当にご親切にありがとうございました。
517:名無しゲノムのクローンさん
03/06/11 00:59
も一つ言うと、150mmプレート使う意味ってあんまり無いんじゃない？直
径が150mm:90mmなら面積は25:9、高々2.5倍でしょ。あんな使いにくいプ
レート50枚まくより90mmのプレート150枚まく方が合理的だと思うけど。
やたら大きいプレートまいて仕事した気分になってる人、もう一度考え直
したら？
518:名無しゲノムのクローンさん
03/06/11 11:02
>517
そんなに使いにくいか？？？
519:名無しゲノムのクローンさん
03/06/12 01:32
酵母の相互作用系をやりたい初心者です、教えてください。
One-Hybridのライブラリー作成＆スクリリーニングキットって
使えますか？なんか出たばっかりなので手を出せずにいます。
ものはアラビです。よろしくおねがいします。
520:名無しゲノムのクローンさん
03/07/09 15:41
クロンテックはだめだね。Three-Hybrid Systemをやってみたけど、
お話にならない。BD, ADヒュージョンに加えて第３のタンパク
（アダプターみたいな感じのタンパク質）をMetプロモーターで誘導
発現させるんだけど、誘導のためにはメチオニンを抜いた培地に置換する。
ところがキットについてくる株(AH109, Y187)は調べたところ
メチオニンを抜いた培地では生育できなかった。
クロンテックに問い合わせたところ、理由は分からないがやはりこれらの株は
メチオニンを抜いた培地では生育しないらしい。
他の先生は苦労しながらも工夫して実験しているだとさ。
元の株が生育しない条件でどうやってスクリーニングしろっちゅうねん！
521:名無しゲノムのクローンさん
03/07/09 15:51
培地にちゃんと硫酸アンモニウムとか入れてる？
522:名無しゲノムのクローンさん
03/07/09 15:56
☆頑張ってまーす！！☆女の子が作ったサイトです☆
☆見て見て！！
URLﾘﾝｸ(yahooo.s2.x-beat.com)
523:名無しゲノムのクローンさん
03/07/10 11:26
age
524:名無しゲノムのクローンさん
03/07/10 21:17
>521
硫酸アンモニウムは終濃度がg/Lとなるように加えています。
クロンテックにMET関連の遺伝子に変異が入っているのか
聞いてみたのですが特にそのようなことはないということでした。
521さんはAH109株がメチオニンを抜いた培地で生育したのでしょうか？
だとしたらもう一度菌体を起こしなおして調べてみます。
525:名無しゲノムのクローンさん
03/07/10 21:24
>524
しかしＡＨ１０９のMetに変異が入ってるのは
うちのラボでは定説です。
いや、絶対入ってるって。
526:名無しゲノムのクローンさん
03/07/10 21:30
ＦＬＡＧとかＭｙｃとか複数のＴａｇ使ってＴＡＰしてとれたcomplexを元に、
Ｙ２Ｈ、ＩＰの実験を行いスクリーニングから取れたと言い張り、論文作成。
その後に、ＴＡＰで複合体をとった論文を作成。
この方法ならソコソココンスタントにＹ２Ｈの論文がかけるけどダメなの？
527:山崎 渉
03/07/12 12:15
__∧＿∧_
|（ ＾＾ ）| ＜寝るぽ（＾＾）
|＼⌒⌒⌒＼
＼ |⌒⌒⌒~| 山崎渉
~￣￣￣￣
528:山崎 渉
03/07/15 13:03
__∧＿∧_
|（ ＾＾ ）| ＜寝るぽ（＾＾）
|＼⌒⌒⌒＼
＼ |⌒⌒⌒~| 山崎渉
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529:名無しゲノムのクローンさん
03/07/21 12:04
>>520
Y187がダメなのはClontechのカタログにもはっきりそう書いてある。
www.clontech.com/techinfo/vectors/ vectorsA-B/pdf/PT3212-5.pdf
だけど、AH109は大丈夫だって書いてあるし、pBridge+AH109でググッたら-MetでcultureしているＤ論もあったよ。
www.biosci.ohiou.edu/faculty/holzschu/liyun.thesis
530:なまえをいれてください
03/07/24 15:45
ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ？(俺を買え）」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。）
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。
531:名無しゲノムのクローンさん
03/08/02 02:33
本日のラボミーティングで、Two-hybrid系を立ち上げることになりました。
初心者で右も左もわからないので、入門用のプロトコール本や詳細の掲載されている
メーカーホームページなど紹介していただけると嬉しいです。
Yeastは扱ったことがないくらい初心者なのですが、現在どこのメーカーのシステム
が優れているのでしょうか？ 大腸菌でできるシステムがどこかからでていたような
気もするのですが、やっぱり真核細胞でやった方がよいのかな？？
（ウィルスのタンパクとアソシエートするマウスの感染細胞内タンパクを
cDNAライブラリーからスクリーニングしようと考えています）
よい情報を御存知の方、優しく指導してくださる先輩諸兄、基礎から叩き
込んでやろうという鬼教官の方々、よろしくです。
532:ぼるじょあ ◆yBEncckFOU
03/08/02 02:53
∧＿∧ ∧＿∧
ﾋﾟｭ.ｰ （ ・３・） ( ＾＾ ） ＜これからも僕たちを応援して下さいね（＾＾）。
＝〔~∪￣￣￣∪￣￣〕
＝ ◎―――◎ 山崎渉&ぼるじょあ
533:名無しゲノムのクローンさん
03/08/04 23:52
>>531
ご近所に酵母やってる部屋があったら、そこの誰かに作法を教えてもらうのがなんつっても楽だよ。慣れればなんてことないんだけど、やってるヤツには当たり前すぎてプロトコルに書かれていないようなところに落とし穴があったりする。なんだったらうち来る？
534:名無しゲノムのクローンさん
03/08/06 16:56
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535:名無しゲノムのクローンさん
03/08/06 22:35
ひろみって、ひょっとして広海？
536:名無しゲノムのクローンさん
03/08/06 22:45
広海＠遺○研
537:名無しゲノムのクローンさん
03/08/06 22:59
今すぐ会いたいの。ひろみはあなたなしじゃもうだめみたい。。。。
私、遺○研にいるから・・・・・ポスドクに来て、くれる？
７日間会費フリー、１０分間無料になってるの、だから来て♪
あなたに会えなくちゃ、寂しくて死んじゃいそうだから
待ってます。来てくださいね！
→ → → URLﾘﾝｸ(www.nig.ac.jp)
538:名無しゲノムのクローンさん
03/08/06 23:03
>>537
不覚にもワロタ
539:名無しゲノムのクローンさん
03/08/12 16:59
せっかくの夏休みなのにっ！アメリカはもう学校ないんだよっ！
むーっ。あたし、あなたに会いにいけないじゃなーいっ！
そーんなイライラ解消ってことで、なんと７日間１０分無料サービス中☆
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なつき、ずっとずっと待ってるからね！遊びに来てね！
え？・・・モチロン、遊びじゃなくてマジなのも大歓迎、だよ(*^.^*)
540:名無しゲノムのクローンさん
03/08/26 22:42
常陸の受託スクリーニング試した人いますか？
541:名無しゲノムのクローンさん
03/09/20 21:38
困った時のtwo-hybrid
542:名無しゲノムのクローンさん
03/10/13 11:16
オレはtwo-hybrid奴隷…
543:名無しゲノムのクローンさん
03/10/16 00:03
「イラストレイテッド」シリーズにtwo-hybridがついに出た！
544:名無しゲノムのクローンさん
03/10/18 07:34
>543
【どんなタンパク同士も】バイオ実験イラストレイテッド two-hybrid【くっつけてみせる !!】
みたいなキャッチコピーなんかな？