10/03/04 10:50:29
>行ってる内容はタンパク質を合成させるために
>Tベクターに導入されているDNA断片を
>別のプラスミドに移し替えるだけの単純な作業です。
ふつう思いついてコンストラクト作成、発現精製、SDS-PAGE,CBB染色は三日で済む作業だろ
465:459
10/03/04 11:58:19
>464
ですよね。ところがプラスミドも出来てない現状ですｗ
先輩がインサートDNAのプライマーを設計してくれたのですが、
制限酵素サイトの前に数塩基置くのを忘れ、
よりにもよってメチラーゼ活性あるのを選んでくれましたｗ
別の制限酵素が使えることが判ったのでやっと進むかと思えば
教授が手法がイヤだとか言い出し差し戻しｗ
教授が満足する手法で始めたら、
久しぶりに実験したくなったとか申され差し戻しｗ
お陰で10回くらいミニカルチャーしてるんじゃないでしょうかｗ
あまりの進度に嫌気が差して今は就活してます(爆)
466:名無しゲノムのクローンさん
10/03/04 12:59:28
プライマーに制限酵素サイトがあろうがなかろうが、pGEX、pMal,pET,pCMVとか発現ベクターのSmaIサイトかEcoRVの
平滑末端サイトにKOD plusやらVentで増幅したPCR断片を直接ライゲーションすれば
コンストラクトなんか二日で終わるだろw
PNKやCIP処理とかすれば無問題だし
467:名無しゲノムのクローンさん
10/03/04 21:22:56
どう見ても研究費を使わせないための教授の策略です。本当にありがとうございました。
468:名無しゲノムのクローンさん
10/03/04 23:10:47
切り出し精製って、ゲルからの抽出ではなくプラスミドからの切り出しが嫌だということ？
それでわざわざPCRでやってんの？
469:459
10/03/05 01:49:55
>466
平滑末端を直接ライゲーションする術があるんですね。
勉強不足の身にありがたいです。調べて今後の糧にさせて頂きます。
ついでになぜ使わないのか教授の機嫌を損ねないようにさり気なく聞いてみますｗ
>467
…言わないで下さい。泣けますからｗ
>468
PCR産物をTベクターに導入したものをとりあえず最終的にpETに移したいのですが、
両方Amp耐性のプラスミドのためセレクションがかけられず
→制限酵素処理して泳動したゲルを切り出し精製してベクターを除いてpETに導入
とゆう方法で行こうとして操作していたら切り出し精製はダメと言われる(爆)
→そうゆうことでCm耐性のプラスミドに導入して選別後pETに導入
とゆう方法に変更。
次pETに入れる段でミニプレップしたサンプルを
直接の指示にてTEに溶かされ、制限酵素の利きが著しく悪化ｗ
TEで内心キレて自主的に春休みになりましたｗ
指示が飛んできた辺りで追加の指示をたくさん貰っちゃって折れた感じです。
ってかTベクターに入れたなら確認にシーケンスくらいすればいいのに
未だに許可が下りずｗ(機器は空いてる気配ですｗ)
470:459
10/03/05 02:11:14
>469
とりあえず理不尽だなと思ってるのは
『なぜ切り出し精製がダメなのか』
→コンタミする可能性がとか仰ってました。何が混ざるんだろ？
『なぜTEに溶かした』
→D3の方の指示でDWに溶かしていた時はよく切れてたんですよ。
教授ご本人が制限酵素処理なさった結果
「利きが悪いな～」とか呟いてました。多分理由はEDTA…
『サンプルコレクター』
→なぜTEに溶かしたって結局コレクション増やしたいだけじゃないかと…
ミニプレップ産物だけTEに溶かして保存するのかと思えば
大腸菌のグリストの作成まで申しつけられました。
頻繁に使うなら兎も角プラスミドあれば十分じゃないでしょうか?!
ご指摘頂き更に
『なぜpETに直接入れさせなかったのか』
とか…
まぁ配列が望み通りになってるか確認するため、
プライマーがあるベクターに入れたかったとか聞きましたが、
ならシーケンスさせろよっ！
実験差し戻しは茶飯事化し、無意味に工数ばかり増え、
もはや目的(タンパク質合成)を忘れてる気すら…(爆)
471:名無しゲノムのクローンさん
10/03/05 07:35:57
>>465
制限酵素サイトの前に数塩基置くのを忘れ、
よりにもよってメチラーゼ活性あるのを選んでくれましたｗ
メチラーゼ活性のないＪＭ１１０なんかをトランスフォーメーションしてそこからＤＮＡを回収すればＯＫ
472:名無しゲノムのクローンさん
10/03/05 10:50:24
オリゴDNAプライマーなんか安いし早いし、さっさと再注文しる
473:459
10/03/05 22:02:28
>466
確度の高いPCRを使えとゆうコトだったんですね←調べたｗ
いつもPCRはEX Taqしか使わないため、
DNAは大腸菌で増やすものとゆう先入観がありました。
>471
その様ですね。
メチラーゼ活性について知った時に菌株の一覧表で見た株です。
別の方もオススメされていたので、
dam-の中では扱い安い株なのかな～とか思いました。
>472
問題はプライマーより教授です。
シーケンスさせてくれと申し出ると、「それより先に～(云々)」
とかわされます。なぜだ～!! …自分がやりたいのかな？
474:名無しゲノムのクローンさん
10/03/06 00:29:19
ぼくは人の能力の高い低いを論じられるほど賢くはないが，指導教官よりも
有能な学生さんがいるとしたら，学生さんからすればさぞストレスだろうと思う。
いまはただ耐えて，はやく出世して欲しい。
475:名無しゲノムのクローンさん
10/03/06 06:07:07
リコンビナントをとるのにシークエンスしていないのは問題外だろう。
プルーフ付きのポリメラーゼだろうがエラーは入る。missenseならともかくnonsenseだったら
どうするんだよ。まずはおおもとのT-vectorのクローンが正しいかどうかの確認が一番先だろ。
476:459
10/03/12 04:01:05
レス遅れてすみません。
>474
総花的な仰り方なので僕に宛てられた文章なのか判りませんが、
もし僕に向けられた言葉でしたら自分が有能とは思っていません。
今回の件に関しては教官の思惑や凡ミスも考えられるので、
もう少し教官の意向に沿ってみようかと思います。
>475
普通シーケンスしますよねぇ。
会う度にシーケンスはいつするのかを聞いており
忘れられているとは思えず、
かつ毎度華麗にスルーされているので、
もう既に誰かがシーケンスしたけど何らかの都合により隠されている
(e.g.データがディレクトリのどっかに消えた プリントしたけど地層に沈んで化石になった etc...)
等ポジティブ(?)に考えてみます。
多くの皆さんにご意見頂きありがとうございました。
これからは言われたコト"も"コナしつつ、
逞しく成果を出せるよう励む所存です。
477:名無しゲノムの食えおーん
10/06/20 13:42:36
実験方法教えてOkwaveみたいなレスになってないか？苦労ニングの方法なんてどうでもええ。方法は無限通りある。
478:名無しゲノムのクローンさん
10/06/20 22:52:52
正しく配列を増幅させたい時ってKOD派？primestar派？
後者はどんな酵素はパンフよんでもなぞだが
479:名無しゲノムのクローンさん
10/06/20 23:46:09
>>470
今気づいたので遅レスだけど、DNAをTEに溶かしたせいで制限酵素で切れなくなるなんて、ありえないよ。
制限酵素バッファーにマグネシウムイオンがどれだけ入ってるかわかってるか？
まあ、他の愚痴については同情するが。
480:名無しゲノムのクローンさん
10/06/20 23:54:13
ん？最近はTaqポリメラーゼとかTthポリメラーゼは使わないのかね？
私が院生の頃はこれらの酵素が熱で失活しないことが大発明とされて
ミネラルオイルを反応液に入れてサーマルサイクラーという最新機器を
使うとDNAがたちどころに増えたものよ。
481:名無しゲノムのクローンさん
10/06/21 01:51:45
KODシリーズってたくさんありすぎ。
KOD
KODPLUS
KODPLUS ver2
KODDASH
KODFX
KODPLUSNEO
482:名無しゲノムのクローンさん
10/06/21 02:11:27
もっともFidelity最強なポリメラーゼってどこのやつなんだろな
483:459
10/06/22 09:13:32
>477
すみません。
最初は腹立ち紛れに書き込みしてたのですが…
>479
DWに溶かしてた要領で切っていたのが敗因かと
参考までに組成を挙げますと
DNA 16μL(TEに溶かしたもの),
BamHⅠ 1μL,EcoRⅠ 1μL,*10K 2μL,
トータル 20μL
せめて水で希釈すれば良かったんですよね(爆)
484:名無しゲノムのクローンさん
10/06/24 03:40:03
>>483
「*10K」というのがよくわからないが、タカラなどの酵素に付いてくる buffer K のことかな。
そうだとしたら、buffer K を使って EcoRI で切ろうとするのは無茶だと思う。
タカラのページでは、EcoRI は buffer K ではスター活性が出やすいと書いてある。
URLﾘﾝｸ(catalog.takara-bio.co.jp)
切れなかったのは、まず間違いなくTEのせいではない。
1x buffer K には 10mM の Mg イオンが入っている。
TEに含まれるEDTAはせいぜい 1mM。
10mM の Mg イオンが 9mM になったところで、制限酵素の活性にはほとんど違いは出ない。